有机磷农药通用抗原二乙基磷酸乙酸单抗的制备

帅丽芳，赵勇，刘文森，银涛

（1.广州军区疾病预防控制中心，广东 广州，510507；2.中山大学 实验动物中心，广东 广州510080）

近年来随着我国工业化进程的加速，食品安全问题也越来越突出。目前我国生产和使用的杀虫剂绝大多数品种为有机磷，最易引起食物农药残留中毒，因而对农产品中农药残留的检测尤为重要。目前有机磷农药残留分析的主要方法是气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）及酶抑制法，气相、液相分析方法虽然检测精度高，但其样品的前处理复杂、检测耗时长、成本高、需要技术熟练的专业人员。而酶抑制法检测农药残留方法灵敏度不高，错检、漏检较多，不能给出定量检测结果，且检测限普遍高于国际和国内规定的残留限量标准值，有待进一步改善。免疫分析方法的原理是基于抗原与抗体间的特异性反应对农药残留进行检测，其特点是灵敏度高、操作简便、检测快速，该方法适用于大批量样本检测和现场快速检测。

有机磷农药相对分子量一般小于400，本身不具有免疫原性，必须将其与载体蛋白偶联才具有诱导产生抗体的能力。本研究选择具有有机磷农药分子中共有官能团作为目标抗原决定簇设计通用人工抗原，进一步制备了该共有结构的有机磷单克隆抗体，并对所得的抗体特性进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1 试材

二乙基磷酸乙酸（购自sigma公司）、N－羟基琥珀酰亚胺（NHS）、PBS缓冲液、硼酸缓冲液（pH＝9）、细胞培养液、HRP标记的羊抗鼠抗体、氯甲酸异丁酯、弗氏（不）完全佐剂、环二己基碳酰亚胺（DCC）、水溶性碳化二亚胺（EDC）、二甲基甲酰胺 （DMF）、卵 清 蛋 白 （OVA）、牛血 清 蛋 白（BSA）、四氢呋喃（THF）、甲基对硫磷、敌百虫、呋喃丹、氧化乐果、毒死蜱（农药均为国产分析纯）、雌性BALB／c小鼠（中山大学实验动物中心）。

1.2 试验方法

1.2.1 半抗原的选择

本实验选择小分子二乙基磷酸乙酸（分子量为196）为半抗原（Hapten，HAP），二乙基磷酸乙酸的结构中包括有1个羧基、2个乙氧基以及1个磷氧基（图1）。

图1 二乙基磷酸乙酸Fig.1 Structure of the hapten diethylphosphonoacetic acid

1.2.2 人工抗原的制备

人工抗原的制备采用混合酸酐法（MAH），将半抗原（HAP）与BSA和OVA载体蛋白分别进行偶联，具体方法按参考文献所述方法［1，2］，经透析纯化后，分别为免疫抗原与包被抗原。

1.2.3 人工抗原的鉴定

将偶联好的人工抗原采用紫外分光光度计法（LANBDA 55）进行测定。大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外吸收峰，但在偶联物紫外扫描光谱中表现出各自光谱图迭加的性质。

1.2.4 免疫方案

将制备好的人工抗原（免疫抗原HAP－BSA）与等体积弗氏完全佐剂混合，用乳化器充分混匀后，皮下多点注射6周龄的健康BALB／c雌性小鼠，每只注射剂量为50μg（以蛋白浓度计）。第一次免疫用弗氏完全佐剂，以后每隔二周，用弗氏不完全佐剂进行免疫，共免疫4次，融合前3d加强免疫1次，并检测小鼠血清抗体效价。

1.2.5 细胞融合、筛选、克隆及亚类鉴定：

融合过程参照金仁耀等［3］的方法进行：骨髓瘤细胞和脾细胞的比例1∶5，融合过程均在无菌条件下进行。取末次免疫后3d的小鼠脾脏，研磨、吹打，收获用脾细胞悬液。将脾细胞悬液（约1×108个）吸入混有2×107个小鼠骨髓瘤细胞，加入BMEM进行融合。将融合的细胞在含有HAT筛选培养基中选择培养，以后每3～4d采用半量换液法更换HT培养基。筛选分泌抗体的细胞株，用有限稀释法对阳性细胞株做克隆化［4］，以获得可稳定分泌特异性单克隆抗体的单克隆杂交瘤细胞株。进一步对杂交瘤细胞株所分泌的抗体进行亚类鉴定［5］。

1.2.6 抗体特异性及对5种农药交叉反应率测定取杂交瘤细胞注射至6周的BALB／c小鼠腹腔，2周后收集小鼠腹水，用于抗体的纯化与鉴定。用PBS缓冲溶液配制浓度为0，0.01，0.10，

1.0 ，5.0，10，50和100mg·L－1的 HAP标准溶液，绘制标准抑制曲线，计算半抗原的半数抑制浓度IC50。将5种农药纯品（甲基对硫磷、敌百虫、呋喃丹、氧化乐果和毒死蜱）作稀释并建立各农药的间接竞争ELISA标准曲线，得出5种农药的半数抑制浓度（IC50，衡量抗体灵敏度，半数抑制率越低，抗体灵敏度越高），并计算交叉反应率［6］（交叉反应率＝［IC50（二乙基磷酸乙酸）／IC50（二乙基磷酸乙酸及其他农药）］×100%）及最低检测限

LOD（LOD＝B0－3SD，B0为不添加抑制物质的对照孔的OD值，SD为标准差）

2 结果与分析

2.1 人工抗原的鉴定

通过紫外可见光分光光度计（LANBDA 55）连续波长（190～400nm）扫描，偶联物的吸收谱图与相应的载体蛋白相比发生明显变化。半抗原与BSA及OVA及其偶联物如图2所示。

2.2 单克隆杂交瘤细胞株及单克隆抗体的制备

免疫4次后的BALB／c小鼠经非竞争性间接ELISA法［7］检测，血清中均检测到抗半抗原的特异性单克隆抗体，血清中抗体效价达到1∶105以上。

细胞融合后，经HAT培养基筛选获得杂交瘤细胞，经间接ELISA法检测杂交瘤细胞培养上清液中的抗体，获得稳定分泌单克隆抗体的单克隆杂交瘤细胞株。

2.3 抗体鉴定

BALB／c小鼠腹水经辛酸／硫酸铵法纯化后，单克隆抗体纯度达到90%以上，分子量为150kD，抗体分型试剂盒检测抗体效价为2.48×105。

2.4 抗体特异性测定

获得的单克隆抗体亚类鉴定为IgG1。

通过绘制间接竞争ELISA标准曲线可算出半抗原半数抑制浓度IC50为0.34μg·mL－1（图3）。

图2 半抗原、偶联物及载体蛋白的紫外扫描图谱Fig.2 UV spectra of hapten，conjugate and carriers

图3 半抗原的间接竞争ELISA标准曲线Fig.3 The standard curve of the indirect competitive ELISA about the hapten

从表1可以看出，二乙基磷酸乙酸单克隆抗体对毒死蜱、氧化乐果、敌百虫的交叉反应率分别为65.39%、38.20%、35.05%，对甲基对硫磷、呋喃丹无交叉反应。毒死蜱在结构上也有一个C2H5O－基，与二乙基磷酸乙酸相似。氧化乐果和敌百虫结构中都含有一个P＝O基和CH3O－基。

3 讨论与结论

大多数农药的免疫化学检测法只针对农药残留检测的需要，给农药的免疫化学检测方法研究提出了新的挑战。

表1 5种农药的半数抑制浓度（IC50）及最低检测限（LOD）Table 1 The half inhibitory concentration （IC50）and the lowest detection limit（LOD）about the five kinds of pesticide

本实验制备的有机磷通用结构抗体，目的是为了检测有相似结构的一类有机磷农药。以有机磷农药通用人工抗原（含有多种有机磷农药分子中共有官能团R 和 R′多 为 甲 氧 基（CH3O—）或乙氧基（C2H5O－），Y 为氧（O）或硫（S）原子，X为烷基、共轭双键、芳香族或其他取代基团［4］）。作为目标抗原决定簇，制备的单克隆抗体能识别含有这种共有结构的一类有机磷农药，进而建立可用于多残留分析的免疫检测法。该方法不仅保持了免疫分析法高灵敏度和高特异性的优势，还可突破传统免疫检测法的瓶颈，拓宽其检测范围，检测其具有共性结构的有机磷农药。本试验以二乙氧基磷酸基团作为目标抗原决定簇，以羧基为活性位点，合成并鉴定了人工抗原，通过细胞融合、克隆，筛选出了能够稳定分泌针对该通用结构的单克隆抗体的细胞株，并对其性能进行了研究。

本实验制备的抗体可以识别筛选具有（C2H5O－）2－P（O或S）－O结构的几种有机磷农药，在检测的5种农药中，对毒死蜱、氧化乐果及敌百虫有较灵敏的反应性，这对于建立有机磷酶联免疫测定方法以及下一步研制快检试剂盒具有重要意义。

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