杂色云芝漆酶对溴酚蓝的高效降解

余昭琴，贾红华，王婷婷，周 华，韦 萍

（南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 210009）

杂色云芝漆酶对溴酚蓝的高效降解

余昭琴，贾红华，王婷婷，周 华，韦 萍

（南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 210009）

以杂色云芝菌（Coriolus versicolor）发酵所产漆酶为催化剂，对溴酚蓝溶液进行脱色处理。探讨了反应温度、反应体系pH、反应时间、酶加入量、溴酚蓝质量浓度及金属离子和小分子介质的添加等因素对溴酚蓝溶液脱色率的影响。实验结果表明：在反应温度为40 ℃、反应体系pH为4.5、反应时间为240 min、酶加入量为60 U/L、溴酚蓝质量浓度为40 mg/L的条件下，溴酚蓝溶液的脱色率达到94.5%；小分子物质2，2′-连氮-双（3-乙基苯并噻吡咯啉-6-磺酸）（ABTS）或金属离子的添加对溴酚蓝溶液的脱色效果没有明显的促进作用。

杂色云芝菌；漆酶；溴酚蓝；脱色；降解；染料废水

染料生产企业排放的大量工业废液，含有多种强毒性物质，如蒽醌类、靛类和三苯甲烷类，对水体和周边生态环境造成严重破坏，严重威胁人类健康。三苯甲烷类染料的使用量在染料家族中仅次于偶氮类染料，难以用一般化学方法处理，也难被微生物完全矿化，寻找对该类染料的新的生物处理方法成为人们关注的问题［1］。杨秀清等［2］构建了白腐菌Trametessp. SQ01和毛壳菌Chaetomiumsp. R01的混合培养体系，对三苯甲烷类染料溴酚蓝进行了脱色研究，结果表明反应3 d后的溴酚蓝降解率为94%。陈敏［3］采用木质素降解酶液对不同染料进行脱色，在脱色温度30 ℃、pH=4.0、H2O2浓度5 μmol/L、混合酶液浓度20 U/mL、溴酚蓝浓度25 μmol/L、脱色时间2 h的条件下，脱色率最高可达85.61%。

漆酶（laccase）是一类可降解木质素的含铜多酚氧化酶［4］，是白腐菌胞外酶的主要组成之一［5］，具有广泛的底物作用范围，可以氧化降解包括单酚、邻苯二酚和对苯二酚在内的多种酚类化合物及其衍生物［6］，在染料降解、污水处理和多环芳香烃的降解等方面有着重要的商业价值［7-9］。目前，漆酶对三苯甲烷类染料脱色降解的研究已经取得了较多进展，但一般降解时间较长［2］，如唐菊［10］用漆酶处理三苯甲烷类染料，反应24 h过程中没有明显的色度变化；姜曼［11］采用鸡腿菇分泌的漆酶粗酶液对染料溶液进行脱色，反应12 h后的脱色率为78%。以上研究均存在脱色降解效率低的问题。因此，开发高效的三苯甲烷类染料的酶法脱色降解工艺显得尤为迫切。

本工作采用本课题组前期分离得到的一株漆酶发酵产量高、生长速率快、易培养的杂色云芝菌（Coriolus versicolor）， 以该菌发酵所得的漆酶粗酶液为降解催化剂，以溴酚蓝溶液脱色率为指标，考察漆酶对三苯甲烷类染料的降解效果，为应用漆酶处理染料废水提供一定的研究基础。

1 实验部分

1.1 材料、试剂和仪器

1.1.1 菌种

杂色云芝菌（Coriolus versicolor）：本实验室分离并保藏。

1.1.2 培养基

斜面培养基：麦芽汁30 g，蛋白胨3 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH=5.6。

种子培养基：麦芽汁30 g，蛋白胨3 g，蒸馏水1 000 mL，pH=5.6。

发酵培养基：葡萄糖1.25 g，羧甲基纤维素钠15 g，酵母膏15 g，KH2PO41 g，MgSO40.25 g，L-天冬氨酸1 g，Tween-80 2 g，CuSO40.5 g，2，5-二甲基苯胺 0.25 g，蒸馏水1 000 mL，pH=4.0。

1.1.3 主要试剂

2，5-二甲基苯胺：分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司；2，2′-连氮-双（3-乙基苯并噻吡咯啉-6-磺酸）（ABTS）：色谱纯，Sigma公司；溴酚蓝：天津市化学试剂研究所。其他化学药品均为国产生化标准试剂或分析纯化学试剂。

1.1.4 主要仪器

DSH2-300A型恒温水浴摇床：苏州培英实验设备有限公司；GENESYS 10S型紫外-可见分光光度计：Thermo公司。

1.2 粗酶液的制备

按文献［12］报道的方法培养杂色云芝菌。在30 ℃摇床培养7 d 后，将发酵液于转速6 000 r/ min下离心8 min，取上清液，即为漆酶粗酶液。

1.3 溴酚蓝溶液的脱色反应

用0.1 mol/L的HAc-NaAc缓冲液配制一定质量浓度的溴酚蓝溶液，取20 mL溴酚蓝溶液于100 mL锥形瓶中，加入发酵制得的漆酶粗酶液，在搅拌转速为100 r/min的恒温水浴摇床中进行脱色反应。分别测定反应前后溴酚蓝溶液在最大吸收波长（591 nm）处的吸光度A0和A，根据式（1）计算脱色率（η，%）［13］。测定时以HAc-NaAc缓冲液为空白。

1.4 发酵液酶浓度的测定

以ABTS为底物，按文献［14-15］报道的方法测定漆酶粗酶液的酶浓度。 酶活力单位（U）定义为1 mL酶液1 min内转化1 μmol ABTS 的酶量。

2 结果与讨论

2.1 反应温度对溴酚蓝溶液脱色率的影响

在反应体系pH为 4.0、反应时间为240 min、酶加入量为150 U/L、溴酚蓝质量浓度为20 mg/L的条件下，反应温度对溴酚蓝溶液脱色率的影响见图1。由图1可见，反应温度为20～40 ℃时，溴酚蓝溶液的脱色率随反应温度的升高而增大，40 ℃时脱色率达到83.1%，而当温度继续升高时脱色率迅速减小。这是由于酶的本质是蛋白质，当温度过高时，酶蛋白发生变性，从而导致脱色率下降。因此，漆酶降解溴酚蓝的较适宜反应温度为40 ℃。

图1 反应温度对溴酚蓝溶液脱色率的影响

2.2 反应体系pH对溴酚蓝溶液脱色率的影响

调整HAc-NaAc缓冲液中HAc-NaAc的配比以调节反应体系pH。在反应温度为40 ℃、反应时间为240 min、酶加入量为150 U/L、溴酚蓝质量浓度为20 mg/L的条件下，反应体系pH对溴酚蓝溶液脱色率的影响见图2。由图2可见，漆酶在pH=4.5条件下对溴酚蓝溶液的脱色率最高，达到92.2%。因此，漆酶降解溴酚蓝的较适宜反应体系pH为4.5。

2.3 反应时间对溴酚蓝溶液脱色率的影响

在反应温度为40 ℃、反应体系pH为4.5、酶加入量为150 U/L、溴酚蓝质量浓度为20 mg/L的条件下，反应时间对溴酚蓝溶液脱色率的影响见图3。由图3可见：当反应时间为240 min时，漆酶对溴酚蓝溶液的脱色率为93.2%；反应时间继续延长，脱色率增大幅度变缓。考虑到节约能耗，因此选择漆酶降解溴酚蓝的较佳反应时间为240 min。

图2 反应体系pH对溴酚蓝溶液脱色率的影响

图3 反应时间对溴酚蓝溶液脱色率的影响

2.4 酶加入量对溴酚蓝溶液脱色率的影响

在反应温度为40 ℃、反应体系pH为4.5、反应时间为240 min、溴酚蓝质量浓度为20 mg/L的条件下，酶加入量对溴酚蓝溶液脱色率的影响见图4。由图4可见：溴酚蓝溶液的脱色率随酶加入量的增大而增大；酶加入量为60 U/L时的脱色率高达93.7%；但当酶加入量继续增大时，脱色率变化不大，推测可能是因为底物被饱和，而酶过量所致。因此，从节约的角度考虑，60 U/L的酶加入量即可达满意的脱色效果。

图4 酶加入量对溴酚蓝溶液脱色率的影响

2.5 溴酚蓝质量浓度对溴酚蓝溶液脱色率的影响

在反应温度为40 ℃、反应体系pH为4.5、反应时间为240 min、酶加入量为60 U/L的条件下，溴酚蓝质量浓度对溴酚蓝溶液脱色率的影响见图5。由图5可见：溴酚蓝质量浓度为40 mg/L时脱色率最大，达到 94.5%；随溴酚蓝质量浓度的增大，脱色率呈现先上升后下降的趋势，表明较高的底物浓度对漆酶产生了抑制作用。因此，较适宜的溴酚蓝质量浓度为40 mg/L。

图5 溴酚蓝质量浓度对溴酚蓝溶液脱色率的影响

2.6 金属离子种类对溴酚蓝溶液脱色率的影响

不同金属离子对酶活力及其稳定性的影响不同，也会影响漆酶对染料的脱色效果。在反应体系中添加不同的浓度为l mmol/L的金属离子，在反应温度为40 ℃、反应体系pH为4.5、反应时间为240 min、酶加入量为60 U/L、溴酚蓝质量浓度为40 mg/L的条件下考察脱色效果。以不添加金属离子的反应体系为对照，金属离子种类对溴酚蓝溶液脱色率的影响见图6。由图6可见，金属离子的添加对脱色效果没有促进作用，这是因为在漆酶发酵的过程中，已经添加了一定浓度的Cu2+来诱导酶的产生，故再次添加金属离子的效果不明显。

图6 金属离子种类对溴酚蓝溶液脱色率的影响

2.7 小分子介质对溴酚蓝溶液脱色率的影响

为提高漆酶对溴酚蓝溶液的脱色效果，分别向反应体系中添加不同浓度的ABTS，在反应温度为40 ℃、反应体系pH为4.5、反应时间为240 min、酶加入量为60 U/L、溴酚蓝质量浓度为40 mg/L的条件下，ABTS加入量对溴酚蓝溶液脱色率的影响见表1。由表1可见，ABTS的添加对脱色效果的影响并不大，这与文献［16］报道不同，可能是由于漆酶的来源不同，导致其降解性能有一定的差别。

表1 ABTS加入量对溴酚蓝溶液脱色率的影响

2.8 溴酚蓝溶液脱色过程中吸收光谱的变化

在反应温度为40 ℃、反应体系pH为4.5、酶加入量为60 U/L、溴酚蓝质量浓度为40 mg/L的条件下，分别对不同反应时间的溴酚蓝溶液在200～700 nm波长范围内进行扫描，反应过程中溴酚蓝溶液的吸收光谱图见图7。由图7可见：溴酚蓝溶液在最大吸收波长591 nm处的吸收峰逐渐消失，说明溴酚蓝在漆酶的作用下被降解；与反应前相比，反应体系在200～500 nm的吸光度增大，这是加入的漆酶粗酶液的吸光度导致的。

图7 反应过程中溴酚蓝溶液的吸收光谱图

3 结论

a）以杂色云芝菌发酵所产漆酶为催化剂，对溴酚蓝溶液进行脱色处理。在反应温度为40 ℃、反应体系pH为4.5、反应时间为240 min、酶加入量为60 U/L、溴酚蓝质量浓度为40 mg/L的条件下，溴酚蓝溶液的脱色率达到94.5%。该结果明显优于文献报道，为生物降解三苯甲烷类染料的后续研究奠定了良好基础。

b）小分子ABTS或金属离子的添加对溴酚蓝溶液的脱色效果没有明显的促进作用。

c）在漆酶的作用下，溴酚蓝溶液在最大吸收波长处的吸收峰逐渐消失，说明漆酶对溴酚蓝具有显著降解效果。

［1］ Kang Hyeon Woo，Yang Yan Hui，Kim Sang Woo，et al. Decolorization of Triphenylmethane Dyes by Wild Mushrooms［J］. Biotechnol Bioprocess Eng，2014，19（3）：519 - 525.

［2］ 杨秀清，王婧人，赵晓霞，等.Trametessp. SQ01和Chaetomiumsp. R01混合培养对四种染料的脱色［J］.环境科学学报，2011，31（3）：518 - 524.

［3］ 陈敏. 刺芹侧耳木质素降解酶的研究［D］. 杭州：浙江大学化学工程与生物工程学系，2010.

［4］ Dittmer J K，Patel N J，Dhawale S W，et al. Production of Multiple Laccase Isoforms byPhanerochaete chrysosporiumGrown under Nutrient Sufficiency［J］. FEMS Microbiol Lett，1997，149（1） ：65 - 70.

［5］ Asgher M，Shahid M，Kamal S，et al. Recent Trends and Valorization of Immobilization Strategies and Ligninolytic Enzymes by Industrial Biotechnology［J］. J Mol Catal B：Enzym，2014，101：56 - 66.

［6］ Jung H C，Xu F，Li K C. Purification and Characterization of Laccase from Wood-Degrading FungusTrichophytonrubrumLKY-7［J］. Enzyme Microbial Technol，2002，30（2）:161 - 1681.

［7］ Dashtban M，Schraft H，Qin W S，et al. Fungal Bioconversion of Lignocellulosic Residues：Opportunities and Perspectives［J］. Int J Biochem Mol Biol ，2009，5（6）：578 - 595.

［8］ Jeon J R，Baldrian P，Murugesan K，et al. Laccase-Catalysed Oxidations of Naturally Occurring Phenols：From in vivo Biosynthetic Pathways to Green Synthetic Applications［J］. Microbiol Biotechnol，2011，5（3）：318 - 332.

［9］ Fu Jiajia，Nyanhongo G S，Gübitz G M，et al. Enzymatic Colouration with Laccase and Peroxidases：Recent Progress［J］. Biocatal Biotransform，2012，30（1）：125 - 40.

［10］ 唐菊. 木质素降解酶对三苯甲烷类染料及竹碱木素降解的初步研究［D］. 重庆：重庆大学生物工程学院，2010.

［11］ 姜曼. 鸡腿菇漆酶诱导、对染料脱色及基因克隆研究［D］. 南京：南京林业大学生物工程学院，2011.

［12］ 徐飞，贾红华，周华，等. 邻苯二酚在水相胶束中的酶促聚合［J］. 精细化工，2014，31（7）：840 - 843.

［13］ 赵丽艳，赵敏，卢磊，等. 一色齿毛菌漆酶-介体系统在染料脱色中的应用［J］. 北京林业大学学报，2011，33（4）：130 - 135.

［14］ 何为，詹怀宇，王习文，等. 一种改进的漆酶酶活检测方法［J］. 华南理工大学学报：自然科学版，2003，31（12）：46 - 50.

［15］ 张鹏. 以ABTS为底物测定漆酶活力的方法［J］. 印染助剂，2007，24（1）：43 - 45.

［16］ 栗君. 产漆酶细菌菌株的筛选及其应用［D］. 哈尔滨：东北林业大学生物工程学院，2014.

（编辑 叶晶菁）

·专利文摘·

一种磷酸银/氧缺陷型二氧化钛复合光催化剂及制备方法

该专利涉及一种磷酸银/氧缺陷型二氧化钛复合光催化剂及其制备方法。该磷酸银/氧缺陷型二氧化钛复合光催化剂是由可见光光催化剂磷酸银负载到氧缺陷型二氧化钛上所形成的，其中磷酸银和氧缺陷型二氧化钛的质量比为1∶（0.015～2.000）。制备方法如下，首先制备氧缺陷型二氧化钛材料，再和银离子混合得到均匀溶液，然后再加入磷酸根离子进行搅拌反应后过滤，将所得滤饼真空干燥即得磷酸银/氧缺陷型二氧化钛复合可见光催化剂。该催化剂用于光催化降解有机污染物罗丹明B的反应活性较高，制备方法简单易行，生产成本低，生产过程污染低，适于工业化规模生产。/CN 104258886 A，2015-01-07

一种聚丙烯酰胺废水处理剂及其制备方法

该专利涉及一种聚丙烯酰胺废水处理剂及其制备方法。废水处理剂以质量份数计包括：聚合氯化铝30～40份，聚丙烯酰胺15～25份，石英砂3～8份，硅藻土1～5份，二甲基二烯丙基氯化铵3～6份，丙烯酰胺5～10份，脂肪胺0.5～2份，聚乙二醇2000 0.5～1份，聚山梨酯0.8～1.5份，乙二胺四乙酸（EDTA）0.1～0.5份，羟丙基甲基纤维素钠1～5份，去离子水60～70份。制备方法为将一定量的二甲基二烯丙基氯化铵、丙烯酰胺、EDTA、聚乙二醇2000、聚山梨酯和去离子水加入反应釜中搅拌均匀，在氮气保护下加入脂肪胺，升温反应得到中间产物Ⅰ；将剩余组分混合得到中间产物Ⅱ，最后将中间产物Ⅰ与中间产物Ⅱ混合即得。/CN 104261494 A，2015-01-07

含酚废水的处理方法

该专利涉及一种含酚废水的处理方法。包括以下步骤：含酚废水通过格栅除去杂质后自流入调节池，用酸或碱溶液将废水pH调节至3～4，然后向废水中加入过氧化氢和硫酸亚铁，在室温下搅拌反应，反应后将废水上清液排出即为处理好的排水。该专利采用过氧化氢和硫酸亚铁对废水中的各类酚类化合物进行氧化降解处理，在最佳工艺条件下，酚类化合物去除率达96%以上，COD去除率达97%，脱色率达99%，废水完全达到排放标准，且具有处理效果好、运行简单及成本低等特点。/CN 104261546 A，2015-01-07

印染废水高效脱色剂及脱色处理方法

该专利涉及一种印染废水高效脱色剂及脱色处理方法。该脱色剂以质量份数计包括：硅藻土100份，活性炭15～25份，高铁酸盐5～10份，氧化铁10～20份，氯化铁10～20份，硫酸钙32～55份，硫酸铝20～50份，有机絮凝剂2.5～5份，水泥25～50份。采用该脱色剂处理印染废水的方法是：向待处理的印染废水中加入该脱色剂，边投加边搅拌，然后再用超导磁分离装置进行分离。该专利能同时快速去除印染废水中疏水性的染料和亲水性的染料，脱色效果好，可不经溶解直接投加，操作简便，在不需要额外添加磁种的情况下就可达到良好的磁分离效果，处理成本低。/CN 104261535 A，2015-01-07

Degradation of Bromophenol Blue by Laccase from Coriolus versicolor

Yu Zhaoqin，Jia Honghua，Wang Tingting，Zhou Hua，Wei Ping
（College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing Jiangsu 210009，China）

The bromophenol blue solution was decolorized by using laccase fromCoriolus versicoloras catalyst. The factors affecting the decolorization of bromophenol blue solution were studied. The experimental results show that：Under the conditions of reaction temperature 40 ℃，reaction pH 4.5，reaction time 240 min，enzyme dosage 60 U/ L and bromophenol blue mass concentration 40 mg/L，the decoloration rate of bromophenol blue solution reaches 94.5%；The additions of small molecule 2，2′-azino-bis（3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid）（ABTS） and metal ions have no signif cant promotion effects on decolorization of bromophenol blue solution.

Coriolus versicolor；laccase；bromophenol blue；decolorization；degradation；dye wastewater

X703

A

1006 - 1878（2015）02 - 0137 - 05

2014 - 09 - 26；

2014 - 12 - 29。

余昭琴（1989—），女，湖北省仙桃市人，硕士生，电话 15205181867，电邮 455411032@qq.com。联系人：周华，电话 025 - 58139916，电邮 zhouhua@njtech.edu.cn。