壳聚糖盐酸盐对几种水产致病菌的抑菌性研究

孙玉英，张继泉*

（1.江苏省海洋资源开发研究院，淮海工学院，江苏 连云港 222005；2.中国科学院 海洋研究所 实验海洋生物学重点实验室，山东 青岛 266071）

目前，对虾疾病仍然是困扰对虾养殖业的一大难题，由弧菌属（Vibrio）细菌引起的弧菌病是其中危害最大的细菌性疾病，给水产养殖业造成了严重的经济损失[1-5]。由于弧菌是海洋环境中最常见的细菌类群之一，广范分布于河口海区以及海洋生物体中，同时弧菌是一类条件致病菌，当水体环境变化，弧菌尤其是致病性弧菌繁殖迅速，如数量超过阈值则容易引发对虾弧菌病。对虾病的防治主要是通过添加化学物质、细菌组分、多糖、动植物提取物、营养因子以及细胞分裂素等免疫增强剂等增强对虾的免疫力[6]。

壳聚糖是天然多糖中唯一的碱性多糖，壳聚糖作为抑菌剂具有毒性低、使用安全等优点[7-8]。目前壳聚糖作为抗菌剂得到了广泛的应用，但壳聚糖较低的溶解性使其应用受到限制，对其进行化学改性后的水溶性衍生物可使其应用领域得到进一步的拓展[9]。其中壳聚糖盐酸盐是将壳聚糖简单改性后的一种水溶性产物。由于壳聚糖盐酸盐保持了壳聚糖的品质，具有良好的成膜性和抑菌性，被用于食品、果蔬等的添加剂和保鲜剂。但壳聚糖盐酸盐被用于水产病害防治尚少见报道。本试验研究壳聚糖盐酸盐对几种水产致病弧菌的抑菌效应，从而探讨壳聚糖盐酸盐用于防治对虾弧菌病的可行性，旨在为对虾弧菌病的防治提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

鳗弧菌（Vibrio anguillarum）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）由淮海工学院海洋学院生物技术实验室提供。

1.1.2 培养基

菌体的保存和培养均采用LB培养基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0。

固体LB培养基在液体培养基基础上添加2%琼脂。

1.1.3 药品

壳聚糖盐酸盐：浙江金壳药业有限公司，脱乙酰度为80.0%～90.0%，黏度为10～120 MPa·s。

1.2 仪器与设备

BS323S电子天平：赛多制斯科学仪器（北京）有限公司；spx-250B-Z生化培养箱：上海博迅实业医疗器械有限公司；HYG全温振荡培养箱：上海欣蕊自动化设备有限公司；LDZM-80KCS立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；HD920新型洁净工作台：北京东联哈尔仪器制造有限公司：Infinite 200 PRO NanoQuant酶标仪：瑞士TECAN公司。

1.3 方法

1.3.1 菌悬液制备

将菌种采用平板划线法接种在平板上培养1 d，挑取单菌落进行扩大培养。液体培养基稀释为107～108CFU/mL。

1.3.2 抑菌圈的测定[10]

用打孔器在滤纸上打出直径6 mm的滤纸片，置于培养皿中高压蒸汽灭菌（121 ℃灭菌20 min）后，备用。实验组浸泡在壳聚糖盐酸盐溶液中，对照组浸泡在无菌水中。

按照无菌操作的要求向无菌培养皿中倒入适量LB培养基，每个培养皿中约10 mL，即培养基的厚度均约为3.6 mm。培养基凝固后，用移液器吸取0.1 mL菌悬液于培养基表面，用涂布棒涂布均匀，然后用镊子取出100 mg/mL溶液中浸泡2 h的滤纸片，将滤纸片轻轻放入培养基表面，每个培养皿等距离放三个滤纸片，用无菌水做空白对照，置于培养皿正中央。放入培养箱恒温培养（培养温度30 ℃，培养时间24 h）。取出后观察并用游标卡尺测出滤纸片抑菌圈直径大小，比较抑菌效果。

1.3.3 最小抑菌浓度测定

每种供试菌均设阳性对照（6个孔只加菌液），阴性对照（6个孔只加无菌培养基）。副溶血弧菌的壳聚糖盐酸盐溶液质量浓度为40 mg/mL，哈维氏弧菌和鳗弧菌的壳聚糖盐酸盐溶液质量浓度为60 mg/mL。在实验组的每一个孔中各加入100 μL菌液，取相应质量浓度的供试药液100 μL加入到实验组的第一个孔中，混匀后，吸取100 μL混合液加入到第二个实验孔，依次稀释下去，直到第十二个孔混匀后吸取100 μL混合液弃去，每种供试菌的实验组均设三组平行实验共三行（每行12个孔）。用酶标仪在600 nm波长处测定其吸光度值，测定结束后将96孔板包好放在30 ℃恒温培养箱中培养。每2 h测一次。以时间为横坐标，OD600nm值为纵坐标绘制出对应的曲线。6～16 h后能抑制培养基内病原菌出现明显生长的最小壳聚糖盐酸盐质量浓度作为最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

2 结果与分析

2.1 壳聚糖盐酸盐的抑菌效力

采用滤纸片扩散法对壳聚糖盐酸盐的抑菌性能进行测定，结果见表1。

表1 壳聚糖盐酸盐对3种供试菌的抑菌圈Table 1 Antibacterial circle of chitosan hydrochloride on three tested strains

由表1可知，壳聚糖盐酸盐对所有供试菌都有抑制作用，但壳聚糖盐酸盐对供试菌的抑菌作用是有差异的。抑菌效力从大到小依次为副溶血弧菌＞哈维氏弧菌＞鳗弧菌。

2.2 不同质量浓度的壳聚糖盐酸盐对供试菌的抑制作用

利用菌液作为阳性对照，灭菌培养基作为阴性对照，不同质量浓度的壳聚糖盐酸盐对供试菌的抑制作用分别见图1～图3。

图1 不同质量浓度的壳聚糖盐酸盐溶液对副溶血弧菌生长的影响Fig.1 Effect of different concentrations of chitosan hydrochloride on the growth of V.parahaemolyticu

图1 结果显示，质量浓度 为20 mg/mL、10 mg/mL、5 mg/mL和2.5 mg/mL的壳聚糖盐酸盐溶液在前10 h内对副溶血弧菌生长具有明显的抑制作用，随着溶液质量浓度增大抑制作用也明显变大，在10～16 h内20 mg/mL和10 mg/mL质量浓度的仍然具有明显的抑制作用，而5 mg/mL和2.5 mg/mL质量浓度的溶液则抑制作用变弱。连续培养16 h后，质量浓度1.25 mg/mL的壳聚糖盐酸盐溶液对副溶血弧菌不再具有抑制作用，因此对副溶血弧菌的最小抑菌质量浓度为2.5 mg/mL。

图2 不同质量浓度的壳聚糖盐酸盐对哈维氏弧菌生长的影响Fig.2 Effect of different concentrations of chitosan hydrochloride on the growth of V.harveyi

图2结果显示，质量浓度为30 mg/mL、15 mg/mL、7.5 mg/mL和3.25 mg/mL的壳聚糖盐酸盐溶液在前16 h内对哈维氏弧菌具有明显的抑制作用，并且随着质量浓度的增大抑制作用也逐渐增大。连续培养16 h后，壳聚糖盐酸盐的质量浓度为1.625 mg/mL时，对哈维氏弧菌的抑制不再明显，因此对哈维氏弧菌的最小抑菌质量浓度为3.25 mg/mL。弧菌的抑菌圈直径最大，因此可以认为壳聚糖盐酸盐对副溶血弧菌的抑菌效果最好。壳聚糖盐酸盐对副溶血弧菌的最小抑菌浓度为2.5 mg/mL，而对哈维氏弧菌和鳗弧菌的最小抑菌浓度3.25 mg/mL。上述研究为壳聚糖盐酸盐运用于对虾弧菌病的防治提供理论依据。

壳聚糖在水质净化、抗菌、提高机体免疫力等方面都具有良好的效果，且其原料丰富，降解产物无毒无害，解决了使用抗生素带来的残留和抗药性问题。因此，其在无公害水产品的养殖生产中有着广阔的应用前景[14-16]，但壳聚糖较低的溶解性使其应用受到限制。壳聚糖盐酸盐是壳聚糖简单改性后的一种水溶性产物，不但保留了壳聚糖在水质净化、抗菌和提高机体免疫力等方面的良好效果，而且壳聚糖盐酸盐对人体具有保健功能。所以探讨壳聚糖盐酸盐用于对虾弧菌病的防治具有重要的理论和现实意义。

图3 不同质量浓度的壳聚糖盐酸盐对鳗弧菌生长的影响Fig.3 Effect of different concentrations of chitosan hydrochloride on the growth of V.anguillarum

图3结果显示，在前6h，质量浓度为30mg/mL、15 mg/mL、7.5 mg/mL和3.25 mg/mL的壳聚糖盐酸盐对鳗弧菌具有明显的抑制作用，随着时间延长，质量浓度降低，抑制作用慢慢减弱。连续培养6 h时，质量浓度为1.625 mg/mL壳聚糖盐酸盐对鳗弧菌不再具有明显的抑制作用，因此壳聚糖盐酸盐对鳗弧菌的最小抑菌浓度为3.25 mg/mL。

3 结论

目前，防治对虾弧菌病害的方法主要是药物防治[11-13]，药物防治虽然具有操作简单，效果显著等优点，但不可避免的会使机体产生一定的耐药性，还会对水域环境造成不同程度的破坏，而且药物残留也会对后续的食品安全造成很大影响。

本实验对壳聚糖盐酸盐的体外抑菌性能进行了研究，采用滤纸片扩散法测定了壳聚糖盐酸盐对副溶血弧菌、哈维氏弧菌和鳗弧菌的抑菌性能。壳聚糖盐酸盐对副溶血

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