定喘止哮颗粒对哮喘豚鼠模型支气管肺泡灌洗液中IL-4和IL-13水平的影响※

仕　丽　罗　威　徐燕南　张丽秀　于秀华　王　檀

定喘止哮颗粒对哮喘豚鼠模型支气管肺泡灌洗液中IL-4和IL-13水平的影响※

仕丽1罗威2徐燕南1张丽秀1于秀华1王檀1

（1长春中医药大学附属医院肺病内科，长春130021；2长春市传染病院中西医结合科，长春130123）

摘要：目的研究定喘止哮颗粒对哮喘豚鼠模型支气管肺泡灌洗液（BALF）中IL-4、IL-13水平的影响。方法采用10%卵蛋白（OVA）肌肉注射、超声雾化吸入致敏建立支气管哮喘豚鼠模型。造模后随机分为模型组，阳性对照药氨茶碱0.025 g/kg组及定喘止哮颗粒4、2、1 g/kg三个剂量组，另外10只为空白对照组。治疗4周后，观察各组豚鼠支气管肺泡灌洗液中IL-4、IL-13的含量。结果与对照组比较，模型组BALF的IL-4、IL-13明显增加（P＜0.01）。定喘止哮颗粒三个剂量组与模型组相比支气管肺泡灌洗液中IL-4、IL-13均有不同程度下降，即定喘止哮颗粒可降低BALF的IL-4、IL-13水平，且剂量越大此作用越明显。结论定喘止哮颗粒可以使IL-4、IL-13水平明显降低（P＜0.01），通过调节Th1/Th2细胞之间的功能平衡，达到拮抗气道炎症的作用，且作用强度与药物剂量有关。

关键词：定喘止哮颗粒；支气管哮喘；肺泡灌洗液；IL-4、IL-13；动物实验

2014年《全球哮喘防治创议》［1］（GINA）中提出支气管哮喘，简称哮喘（bronchial asthma）是一种慢性呼吸道异质性疾病，以慢性气道炎症为核心，由多种炎症细胞和细胞组分参与，是目前世界上最常见的慢性疾病之一。全球约有3亿患者，我国平均患病率为0.5%～1.0%，其发病率和病死率呈逐年攀升趋势。本病的发病机理较为复杂，其中Th1/Th2细胞失衡被认为是哮喘免疫学发病的重要基础，因此，纠正Th1/Th2失衡状态是治疗哮喘的关键。IL-4则被视为机体Th1/Th2细胞失衡的重要信号因子之一。研究表明，哮喘支气管肺泡灌洗液中TGF-β和IL-13的水平显著升高［2］。IL-13作为Th2细胞分泌的多效应细胞因子，是哮喘气道重塑过程的重要参与者［3］。目前，针对这些对气道慢性炎症具有特殊作用的细胞因子已展开深入研究，如阻断IL-4/IL-13［4］、IL-33［5］、IL-35［6］等。我们在临床中应用中药定喘止哮颗粒治疗支气管哮喘患者由于内风导致发作，取得较好疗效，在此基础上，通过复制哮喘豚鼠模型，观察定喘止哮颗粒对哮喘豚鼠支气管肺泡灌洗液中IL-4、IL-13水平的影响，研究其对气道炎症的作用，探讨中药定喘止哮颗粒治疗支气管哮喘的作用机理。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1主要试剂卵清蛋白（Sigma公司）；白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-5（IL-5）ELISA试剂盒、γ-干扰素(IFN-γ)ELISA试剂盒（美国RB公司）。

1.1.2实验动物科研试验用豚鼠，雌雄各半，体重250～350 g。动物合格证号：SCXK(吉)-2012-0002，由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供。

1.1.3药品定喘止哮颗粒，批号：20121008，长春中医药大学提供；阳性对照药氨茶碱片，规格：0.1 g/片，批号：B120703，山西云鹏制药有限公司产品；甲醛溶液，规格：分析纯，500 ml/瓶，批号：20090419，沈阳经济技术开发区试剂厂产品。

1.1.4仪器生理信号采集系统，型号：Powerlab/8sp，澳大利亚埃德公司产品；贺利氏（Heraeus）台式离心机Stratos，型号：Biofuge Stratos，德国贺利氏公司产品；电子天平，型号：BSA224S，北京赛多利斯公司产品；酶标仪，型号：BIO680，美国伯乐公司产品；医用超声雾化吸入器，上海医疗器械厂。

1.2实验方法[7，8]

1.2.1动物分组取体质量250～350 g豚鼠60只，雌雄兼用，随机分为6组，每组10只。

1.2.2造模方法除对照组动物外，其他组动物用10%卵蛋白肌肉注射致敏，4周后，将豚鼠置于密闭有机玻璃箱中，用1%卵蛋白超声雾化吸入2 min进行攻击。

1.2.3给药方法阳性对照药组：氨茶碱0.025 g/kg，定喘止哮颗粒组：4、2、1 g/kg三个剂量。均于致敏同时灌胃给药，空白对照组给予同体积的蒸馏水。

1.2.4检测项目各组分别于给药4周后，除正常组外，各组激发哮喘后即处死，以生理盐水行全肺灌洗，充分回收，反复3次，制备肺泡灌洗液约2 mL，离心去取上清液-70℃冰箱保存。用ELISA法测定肺泡灌洗液中的IL-4、IL-13含量。

1.3统计方法采用SPSS19.0统计学软件进行统计学分析，各组实验数据均数±标准差（x±s）表示，结果以采用组间t检验。

2　结果

在本研究中，与对照组比较，哮喘模型组豚鼠肺泡灌洗液中IL-4、IL-13含量明显增高，有显著性差异（P＜0.01）。与模型组比较，各给药组豚鼠肺泡灌洗液中IL-4、IL-13水平明显下降，有显著性差异（P＜0.01）。定喘止哮颗粒4、2、1 g/kg三个剂量组均能抑制支气管哮喘模型豚鼠肺泡灌洗液的IL-4、IL-13含量，剂量越大此作用越明显。详细结果见表1。

表1　定喘止哮颗粒对哮喘豚鼠模型支气管肺泡灌洗液中IL-4和IL-13水平的影响(x±s，n=10)

3　讨论

支气管哮喘属于中医学“哮证”“喘证”范畴，具有发作性的特点和痰鸣气喘、哮鸣有声的临床表现，甚者呼吸困难、不能平卧。哮喘发病率增高，目前认为哮喘为身心疾病，随病程延长由外源性诱因诱发的发作渐已淡化，情绪等内源因素在其发作中有重要的作用。课题组认为肝阳偏亢，内风上逆冲肺，则贯穿哮病发作期的始终。其发作时证候特点：喘息，喉中哮鸣有声，伴咳嗽，咯痰，胸膈满闷，情绪不宁，心烦易怒，腰膝酸软，面色潮红，舌红苔黄腻，脉弦。故认为本病中老年患者内源性发病基础为：肾精不足，水不涵木，阴不敛阳，肝阳偏亢，虚阳浮动，生风迫肺，故作哮喘。针对此类患者急性发作期治疗立熄风定喘止哮为法，制定喘止哮颗粒临床应用效果较好，且不易复发。

哮喘的发病机制：Th1/Th2功能失衡，Th2细胞优势表达可导致哮喘发作。Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-13等，诱发肥大细胞和嗜酸性粒细胞（EOS）生长分化以及包括IgE在内的免疫球蛋白生成。IL-4可能在哮喘早期起作用，而IL-13可能在哮喘的维持和发展中起重要作用［9］。IL-4是Th2细胞的特征性细胞因子。IL-4能促进B细胞增殖、生长并产生IgE，放大且增加IgE的产生和效应，从而间接或直接诱导产生气道高反应性及炎症。IL-4还可促进Th0细胞分化为Th2细胞，并抑制Th1细胞的效应。IL-13是Th2细胞分泌的多效应细胞因子，可以不断激活机体内的嗜酸性粒细胞，并抑制其凋亡，同时可直接促使B细胞分化，增加IgE分泌，进而广泛地参与到哮喘发病的整个过程，提升哮喘发生的危险性［10、11］。

本试验结果表明，定喘止哮颗粒可以使IL-4、IL-13水平明显降低。定喘止哮颗粒通过对IL-4、IL-13的拮抗作用，调节Th1/Th2细胞的功能平衡，降低气道炎症反应，从而达到缓解哮喘的发作，充分发挥了中药制剂调节机体动态平衡的优势，且副反应小，有良好的临床价值。

参考文献

[1]Global strategy for asthmamanagementand prevention[EB/OL]．Global Initiative for Asth（GINA）．2014．http://www．ginasthma．org/up-loads/users/files/GINAReport-2014．pdf

[2]李蓓，王敏．转化因子TGF-β与结缔组织生长因子在哮喘气道重构中的作用[J]．临床肺科杂志，2009，14(10):1346-1348．

[3]Kips JC，Anderson GP，Fredberg JJ，et al．Murinemodels of asthma[J]．Eur R espir J，2003，22(2):374-382．

[4]彭程．IL-4/IL-13阻断效应的重组IL-4乳酸杆菌治疗哮喘的作用效果分析[J]．海南医学院学报，2015，21(5):633-638．

[5]郑瑞兵，吴峰．白介素33在支气管哮喘发病机制中的作用[J/OL]．中国哮喘杂志（电子版）．2012，6(1):35．

[6]顾香，陈吉泉，李兵．白介素35在支气管哮喘中的作用机制[J/OL]．中国哮喘杂志（电子版）．2012，6(4):277．

[7]章晓初，姚婉贞，何其华．哮喘豚鼠气道重塑与气道反应性的图象分析[J]．中华结核与呼吸杂志，2001，24(2)：87-89．

[8]柳春，李智，吕国军，等．滨篙内醋对哮喘豚鼠IL-4和IFN-Y含量的影响[J]．中国药理学通报，2003，19(6)：653-655．

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[10]杨华，黄桂红．Th1/Th2细胞因子失衡在哮喘发病机制中的作用[J]．临床肺科杂志，2013，18(12):2271-2272．

[11]Tabata Y，Khurana Hershey GK．IL-13 receptor isoforms:breaking through the complexity[J]．Curr Allergy Asthma R ep，2007，7(5):338-345．

科合字[2013]第87号）

doi:10.3969/j.issn.1672-2779.2015.18.073

文章编号：1672-2779（2015）-18-0142-02

收稿日期：（本文编辑：张文娟本文校对：杨海淼2015-08-13）

基金项目：※吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目（No：吉教

SHI Li1， LUO Wei2， XU Yannan1， ZHANG Lixiu1， YU Xiuhua1， WANG Tang1
(1. Department of Integrated Medicine， Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine， Changchun 130021，China；2. Department of Integrated Medicine， Changchun City Hospital of Infectious Diseases， Changchun 130123， China)

Abstract：Objective To investigate the Effectof Dingchuan Zhixiao granule on the levelof IL-4 and IL-13 in bronchoalveolar lavage fluid of the asthmamodelguinea pig.M ethods Guinea pigmodelof bronchial asthma wasestablished adopting 10% OVA muscle injection and ultrasonic atomizing inhalation.They were random ly divided into model group,The positive control drug aminophylline 0.025 g/kg group, three Dingchuan Zhixiao granule groups(4 g/kg,2 g/kg and 1 g/kg),and 10 cases in blank controlgroup.After 4 weeks＇ treatment,contents of IL-13 and IL-4 in bronchoalveolar lavage fluid were observed.Results Comparimg with control group,the IL-4 and IL-13 in bronchoalveolar lavage fluid of themodel group increased significantly(P＜0.01).Comparing with themodel group,the IL-4 and IL-13 in bronchoalveolar lavage fluid of the three Dingchuan Zhixiao granule groupshad differentdegreesof decline.Dingchuan Zhixiao granule can reduce the level of IL-13 and IL-4 in bronchoalveolar lavage fluid,and the higher the dose,the more obvious the effect.Conclusion Dingchuan Zhixiao granule can reduce the level of IL-13 and IL-4 in bronchoalveolar lavage fluid significantly,by regulating the function of Th1/Th2 cells,the function of the airway inflammation is reached,and the intensity ofaction is related to the dose.

Keywords：Dingchuan Zhixiao granule；bronchial asthma；bronchoalveolar lavage fluid；IL-4；IL-13；animal experiment