rHuEPO对盲肠结扎穿孔术+检验性失血大鼠急性肾损伤的保护作用

周忠义，谢晓红，吴远怡，田 佳，魏晓芬

(海南省人民医院重症医学科，海南 海口 570311)

rHuEPO对盲肠结扎穿孔术+检验性失血大鼠急性肾损伤的保护作用

周忠义，谢晓红，吴远怡，田 佳，魏晓芬

(海南省人民医院重症医学科，海南 海口 570311)

目的 探讨重组人促红细胞生成素(rHuEPO)对盲肠结扎穿孔术(CLP)+检验性失血大鼠急性肾损伤的保护作用。方法160只SD大鼠CLP术后按照随机数表法取均分为四组(对照组、小剂量组、中剂量组和大剂量组)，每组各40只，四组均关腹后0 h、24 h、48 h尾静脉放血1 ml，小剂量组0 h皮下注射3 000 U/kg+生理盐水1 ml(24 h、48 h皮下注射生理盐水1 ml)，中剂量组0 h、24 h皮下注射rHuEPO 3 000 U/kg+生理盐水1 ml(48 h皮下注射生理盐水1 ml)，大剂量组0 h、24 h、48 h皮下注射3 000 U/kg+生理盐水1 ml，对照组0 h、24 h、48 h皮下注射生理盐水1 ml，分笼饲养，72 h每组各取5只经心脏取血2 ml，检测血红蛋白(Hb)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、肿瘤坏死因子(TNF-α)，检测肾脏丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶活性(MPO)、核转录因子(NF-κB)表达和末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口标记(TUNEL)阳性细胞数。结果大中剂量组BUN、Cr、TNF-α、MDA、MPO、NF-κB、TUNEL阳性细胞数分别与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，大剂量组较中剂量组差异有统计学意义(P＜0.05)，而小剂量组上述指标分别与对照组比较差异则均无统计学意义(P＞0.05)，四组的Hb比较差异无统计学意义(P＞0.05)。结论rHuEPO能够降低盲肠结扎穿孔术+检验性失血所致急性肾损伤大鼠TNF-α、MDA、MPO、NF-κB表达和TUNEL阳性细胞数，对脓毒症和检验性失血双重打击急性肾功能损伤具有一定的保护作用，且呈剂量依赖性。

重组人促红细胞生成素；盲肠结扎穿孔术；检验性失血；急性肾损伤

脓毒症是重症医学科(ICU)内患者的主要死亡原因之一，脓毒症合并急性肾损伤(Acute kidney injury，AKI)的发生率为19%～23%[1]。抽血行实验室检测是住院患者的常规措施，危重患者更是需要频繁地抽血化验以协助诊断和指导治疗。检验性失血加重组织器官缺氧，使危重患者雪上加霜，增加病死率和医疗费用，影响预后[2-3]。脓毒症+检验性失血已成ICU中常见的合并症。本实验拟探讨重组人红细胞生成素(Recombinant human erythropoietin，rHuEPO)对脓毒症+检验性失血大鼠急性肾损伤有无保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级SD雄性大鼠160只，体重250～280 g，由海南医学院动物实验室提供。所有动物均自由觅食和觅水。

1.2 实验方法 所有动物实验前夜禁食，自由饮水。10%水合氯醛(0.3/kg体重)腹腔注射麻醉，腹部正中线切开腹壁进入腹腔，在盲肠中段50%处结扎并用9#针头在盲肠结扎的远端中间位置全层穿透，并轻挤出少许粪便以保证穿孔处的开放性。盲肠放回腹腔，连续缝合关腹。各组均于术毕皮下注射生理盐水30 ml/kg，以补充术中液体的丢失。所有动物手术在10 min之内完成，保持一致性，术后分笼饲养。术后按照随机数字表法均分为四组(对照组、小剂量组、中剂量组和大剂量组)，每组各40只，四组均关腹后0 h、24 h、48 h尾静脉放血1 ml，小剂量组0 h皮下注射3 000 U/kg+生理盐水1 ml(24 h、48 h皮下注射生理盐水1 ml)，中剂量组0 h、24 h皮下注射3 000 U/kg+生理盐水1 ml(48 h皮下注射生理盐水1 ml)、大剂量组0 h、24 h、48 h皮下注射rHuEPO 3 000 U/kg+生理盐水1 ml对照组0 h、24 h、48 h皮下注射生理盐水1 ml，分笼饲养，72 h后每组各取5只经心脏取血2 ml，检测血红蛋白(Hb)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、肿瘤坏死因子(TNF-α)，检测肾脏丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶活性MPO、核转录因子(NF-κB)表达和末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口标记(TUNEL)阳性细胞数。

1.3 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较用成组t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 rHuEPO对盲肠结扎穿孔术+检验性失血大鼠BUN和Cr的影响 小剂量组大鼠的BUN、Cr与对照组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，中大剂量组BUN、Cr与对照组和小剂量组比较明显下降，大剂量组又比中剂量组明显下降，差异均具有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 72 h后不同剂量rHuEPO对盲肠结扎穿孔术+检验性失血大鼠BUN和Cr的影响(±s)

表1 72 h后不同剂量rHuEPO对盲肠结扎穿孔术+检验性失血大鼠BUN和Cr的影响(±s)

注：与对照组比较，aP＞0.05；与对照组比较，bP＜0.05；与小剂量组比较，cP＜0.05，与中剂量组比较，dP＜0.05。

组别Cr(μmol/L)BUN(mmol/L)对照组(n=40)小剂量组(n=40)中剂量组(n=40)大剂量组(n=40)89.385±6.182 86.960±6.885a70.115±7.031bc61.308±6.007bcd29.612±6.310 28.372±7.042a17.932±5.309bc11.073±4.607bcd

2.2 rHuEPO对盲肠结扎穿孔术+检验性失血大鼠TNF-α、肾脏NF-κB、MPO、MDA、TUNEL细胞凋亡的影响 小剂量组血清中TNF-α及肾脏NF-κB、MPO、MDA、TUNEL数目与对照组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，中大剂量组血清中TNF-α及肾脏NF-κB、MPO、MDA、TUNEL数目与对照组和小剂量组比较明显下降，大剂量组又比中剂量组明显下降，差异均具有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 72 h后rHuEPO对盲肠结扎穿孔术+检验性失血大鼠TNF-α、肾脏NF-κB、MPO、MDA、TUNEL细胞凋亡的影响(±s)

表2 72 h后rHuEPO对盲肠结扎穿孔术+检验性失血大鼠TNF-α、肾脏NF-κB、MPO、MDA、TUNEL细胞凋亡的影响(±s)

注：与对照组比较，aP＞0.05；与对照组比较bP＜0.05；与小剂量组比较，cP＜0.05；与中剂量组比较，dP＜0.05。

组别对照组(n=40)小剂量组(n=40)中剂量组(n=40)大剂量组(n=40)TNF-α(pg/ml)90.503±4.30 89.141±4.52a76.503±4.38bc68.033±3.79bcdNF-κB(IOD)20397.079±3217.869 19515.326±4112.805a15042.572±2206.773bc12150.746±1215.906bcdMPO(U/g)2.11±0.12 1.95±0.37a1.05±0.23bc0.54±0.13bcdMDA(nmol/mg)16.56±4.46 15.82±3.62a11.79±2.05bc8.03±1.92bcdTUNEL 0.779±0.039 0.763±0.211a0.604±0.083bc0.516±0.112bcd

2.3 rHuEPO对盲肠结扎穿孔术+检验性失血大鼠Hb的影响 四组血清中Hb变化不明显[对照组Hb(97.7±6.7)g/L，小剂量组(98.7±5.9)g/L，中剂量组(100.4±6.2)g/L，大剂量组(101.5±7.4)g/L]，差异均无统计学意义(P＞0.05)。

3 讨论

脓毒症是感染导致的全身性炎症反应综合征，可进展为脓毒性休克和多器官功能障碍综合征，是危重病患者常见的死亡原因之一[4]。危重病患者因为器官受损、内环境紊乱，病情危重，临床上为了及时协助诊断、严密监测病情、指导治疗和判断预后，需要频繁抽血检验，由此造成的检验性失血在所难免。失血会导致血液携氧能力下降，难以满足危重病患者高分解代谢状态的氧需求，它更加加重了组织器官缺氧，明显降低患者的免疫力，诱发器官损伤，增加心血管、呼吸系统的应激性和相关疾病的发生率，严重影响患者的预后。检验性失血使静脉输血的需求增加，与输血相关的副作用和并发症也增多，从而使住院时间延长，病死率增高，医疗费用增加。在临床实践中发现，脓毒症一旦合并肾脏损害，治疗难度明显增加，急性肾损伤已被视为脓毒症的独立死亡因素。研究脓毒症急性肾损伤合并检验性失血的治疗有重要临床意义。

促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)是由肾脏及胚胎的肝脏产生的一种含酸性糖蛋白，血液中的EPO由165个氨基酸残基构成。1985年促红细胞生成素的分子产物克隆成功，之后利用基因重组技术大批量生产重组人促红细胞生成素(rHuEPO)，并广泛应用于临床。在rHuEPO的临床应用过程中，主要是作为一种调节红细胞生成的生长刺激因子在使用，用于治疗贫血。近年研究发现促红细胞生成素受体(EPOR)也可以同时在中枢神经系统、肺、肾脏、胃肠道、视网膜、心脏等器官表达，而且还发现，EPO除了具有调节红细胞生成的功能外还具有抵抗炎症、抗凋亡、促进血管生成、抗氧化应激等一些造血以外的功能[5]。Kumral等[6]认为，EPO在炎症反应过程中具有类似类固醇样的抗炎作用，可抑制炎性细胞的浸润和前炎性因子的表达。Tsao等[7]证明EPO可以降低脓毒症大鼠血清中IL-6的水平和肺组织iNOS的表达，对脓毒症急性肺损伤有保护作用。Soiling等[8]证明EPO可以调节炎症反应改善脓毒症引起的肾脏血流动力学障碍，降低脓毒症大鼠血清中IL-10、TNF-α的水平，对脓毒症急性肾损伤有保护作用。

本研究观察到重组人促红细胞生成素干预治疗明显减少盲肠结扎穿孔术+检验性失血大鼠72 h后BUN、Cr，证实rHuEPO对盲肠结扎穿孔术+检验性失血大鼠急性肾损伤具有保护作用。进一步研究发现大中小剂量组较对照组大鼠Hb上升，但差异无统计学意义(P＞0.05)，提示这种方法的重组人促红细胞生成素干预不能改善盲肠结扎穿孔术+检验性失血大鼠的贫血状态，说明rHuEPO对急性肾损伤的保护作用与贫血改善之间无必然联系。

脓毒症所致多器官功能障碍综合征是机体炎症反应失控的结果，其核心是全身炎症反应与代偿性抗炎反应失衡[9]。脓毒症早期肾组织细胞凋亡数量增加，肾组织细胞的凋亡与细胞因子大量释放等因素有关；同时肾缺血再灌注(I/R)损伤又加速了肾组织细胞凋亡的发生[10]。目前认为脓毒症肾损伤发病机制与血流动力学的变化、内毒素与炎性介质、细胞凋亡等因素有关[11]。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是细胞因子中最早出现的最主要的一种，它启动后续的一系列病理生理改变来参与炎症反应。核转录因子(NF-κB)是细胞内重要的核转录因子，启动和调控多种炎症因子的基因转录，其激活可触发炎性因子的“瀑布样级联反应”和促进细胞凋亡，介导脓毒症多器官功能损伤。TNF-α、NF-κB是常用的评价机体炎症反应程度和治疗效果的指标之一[12]。氧化应激反应是因为机体活性氧产生太多，超过了机体抗氧化物质的清除能力引起组织细胞损害的一种应激反应。丙二醛(MDA)为一种脂质过氧化产物，它的变化可以间接反应过脂质过氧化反应程度。髓过氧化物酶活性(MPO)是中性粒细胞在组织中浸润的一个生化标记，可以反映炎症损伤的程度。末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口标记(TUNEL)阳性细胞数反映细胞凋亡。肾是分泌EPO的主要器官，有EPOR表达。有学者研究认为rHuEPO与肾EPOR结合后通过各种信号途径可抑制炎性反应，减轻超氧损伤，减少细胞凋亡和坏死，减轻内皮损害、肾血管球硬化和小管间质性损伤而发挥肾保护作用[13-14]。本研究发现应用rHuEPO处理使得盲肠结扎穿孔术+检验性失血急性肾损伤大鼠TNF-α、NF-κB、MDA、MPO、TUNEL阳性细胞数下降，剂量越大效果越明显，说明rHuEPO通过减轻氧化应激及炎症因子释放抑制全身炎症反应和减少细胞凋亡对急性肾损伤起保护作用。

综上所述，我们认为，rHuEPO通过调节NF-κB的表达，降低TNF-α水平，减轻氧化应激抑制全身炎症反应和减少细胞凋亡对盲肠结扎穿孔术+检验性失血大鼠急性肾损伤起保护作用。

[1]Mori T,Shimizu T,Tani T.Septic acute renal failure[J].Contrib Nephrology,2010,166:40-46.

[2]姜东辉,万献尧.实验室检验失血与医源性贫血——ICU的潜在危机[J].医学与哲学(临床决策论坛版),2007,28(6):50-52.

[3]Corwin HL,Gettinger A,Pearl RG,et al.The CRIT Study:Anemia and blood transfusion in the critically ill-current clinical practice in the United States[J].Crit Care Med,2004,32(1):39-52.

[4]Protti A,Singer M.Bench-to-bedside review:potentia strategies to protect or reverse mitochondrial dysfunction in sepsis-induced organ failure[J].Crit Care,2006,10(5):228.

[5]Brines M,Patel NS,Villa P,el a1.Nonerythropoietic,tissueprotective peptides derived from the tertiary sffucture oferythropoietin[J]. Proc NatlAcad Sci,2008,105(31):10925-10930

[6]Kumral A,Baskin H,Yesilirmak DC,et a1.Erythropoietin attenuates lipopolysaeeharide-induced white matter injury in the neonatal rat brain[J].Neonatology,2007,92(4):269-278

[7]Tsao CM,Chen SJ,Shih MC,et a1.Effects of terbutaline on circulatory failure and organ dysfunction induced by peritonitis in rats[J]. Intensive Care Med,2010,36(9):1571-1578

[8]Soiling C,Christensen AT,Kraq S,et a1.Erythropoietin administration is associated with short-term improvement in glomerular filtration rate after ischemia-reperfusion injury[J].Acta Anaesthesiol Scand,201l,55(2):185-195

[9]孔金丹.多器官功能障碍综合征发病机制的研究进展[J].实用老年医学,2010,24:245-247.

[10]Aird WC.The role of the endothelium in severe sepsis and multiple organ dysfunction syndrome[J].Blood,2003,101:3765-3777.

[11]Messaris E,Memos N,Chatziqianni E,at e1.Apoptotic death of renal tubular cells inexperimental sepsis[J].Surq Infect,2008,9(3): 377-388.

[12]Monick MM,Hunninghake GW.Activation of second messenger pathways in alveolar macrophages by endotoxin[J].Eur Respir J, 2002,20(1):210-222

[13]Walden AP,Young JD,Sharpies E.Bench to bedside:A role for erythropoietin in sepsis[J].Crit Care,2010,14(4):226-227

[14]Mitra A,Bansal S,Wang Wei,et a1.Erythropoietin ameliorates renal dysfunction during endotoxaemia[J].Nephrol Dial Transplant, 2007,22(8):2349-2353

Protective effects of recombinant human erythropoietin in rats with acute kidney injury under cecal ligation and puncture and blood loss during laboratory test.

ZHOU Zhong-yi,XIE Xiao-hong,WU Yuan-yi,TIAN Jia,WEI Xiao-fen.Intensive Care Unit,People's Hospital of Hainan Province,Haikou 570311,Hainan,CHINA

ObjectiveTo discuss the protective effects of recombinant human erythropoietin(rHuEPO)in rats with acute kidney injury under cecal ligation and puncture(CLP)and blood loss during laboratory test.MethodsOne hundred and sixty SD rats were averaged into four groups(control group,low-dose rHuEPO group,median-dose rHuEPO group and high-dose rHuEPO group)through the random number table after CLP.1 ml of tail vein blood each was taken 0 h,24 h,48 h after the abdomen closure.rHuEPO 3 000 U/kg+saline 1 ml was injected subcutaneously in low-dose rHuEPO group at the time of 0 h,and 1 ml of saline was injected respectively at 24 h and 48 h. rHuEPO 3 000 U/kg+saline 1 ml was injected subcutaneously in median-dose rHuEPO group at the time of 0 h and 24 h, and 1 ml of saline was injected at 48 h.rHuEPO 3 000 U/kg+saline 1 ml was injected subcutaneously in high-dose rHuEPO group at the time of 0 h,24 h and 48 h.The control group was injected with normal saline 1 ml each at the time of 0 h,24 h and 48 h.Rats were separated in different cages for 72 h,then 5 out of each group were selected and drew 2 ml of blood each from the hearts to test hemoglobin hemoglobin(Hb),urea nitrogen(BUN),creatinine(Cr),tumor necrosis factorα(TNF-α),as well as the expression of malonaldehyde(MDA),myeloperoxidase(MPO)and nuclear factor-κB(NF-κB)in their kidneys,and also,the amount of terminal dexynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling(TUNEL)positive cells.ResultsThe median-dose rHuEPO and high-dose rHuEPO group showed statistically significant differences respectively with the control group in the test results of BUN,Cr, TNF-α,MDA,MPO,NF-κB and TUNEL positive cells(P＜0.05).The differences in the above indexes between the high-dose rHuEPO group and the median-dose rHuEPO group were statistically significant(P＜0.05),while the differences between the low-dose rHuEPO group and the control group was not different(P＞0.05).The four groups showed no statistically significant difference from each other inHb(P＞0.05).ConclusionrHuEPO could decrease the expres-sion of MDA,MPO,NF-κB and the TUNEL positive cells in the rats with acute kidney injury under the circumstances of CLP and blood loss during laboratory test.It has a certain extent of protective effects for the acute kidney injury caused by sepsis and blood loss during laboratory test,which also demonstrates a feature of dose-dependence.

Recombinant human erythropoietin(rHuEPO);Cecal ligation and puncture;Blood loss during laboratory test;Acute kidney injury

R-332

A

1003—6350（2015）17—2503—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.17.0908

2015-04-14)

海南省卫生厅科研立项课题(编号：琼卫2012PT—02)

周忠义。E-mail：adslzhouzy@sina.com