鸭瘟病毒PCR快速检测方法的建立及应用

于新友 李天芝 刘吉山 沈志强，

(1山东绿都生物科技有限公司 山东滨州 256600 2山东省滨州畜牧兽医研究院 山东滨州 256600)

鸭瘟（duckplague，DP）是由鸭瘟病毒（DPV）引起的鸭、鹅等水禽的败血性、高度致死性传染病[1]，其特征为两腿麻痹、下痢、流泪和部分病鸭头颈肿大[2]。是危害养鸭业最严重的传染病之一[3]，是OIE规定的B类传染病，给世界各国养鸭业造成了较大经济损失[4]。1923年，Baudet[5]首次报道荷兰的家鸭暴发鸭瘟。目前，该病呈世界性分布，1957年我国首次报道该病。检测DPV的常规方法有病毒分离、酶联免疫吸附和琼扩试验等，这些方法均有较多缺点如耗时长、检测敏感性较低及准确性差等，尤其对处于潜伏期的鸭不能检出其体内的DPV感染。PCR具有检测速度快、特异性好和灵敏度高等优点，已经广泛应用于细菌、病毒的诊断检测并展示其良好的应用前景。而应用PCR技术对鸭瘟进行诊断，能快速地检测出是否有DPV，是常规检测方法无法比拟的。因此，建立1种DPV病毒PCR检测方法对于DPV的早期临床诊断，从而采取适当的措施，防止鸭瘟的大规模暴发有很重要的意义。

本研究根据GenBank公布UL30（EF554403）基因序列，设计了1对特异性引物，建立了1种特异、敏感的DPV检测方法，旨在为DPV的早期诊断、流行病学调查等提供1种有效的分子生物学检测方法。

1 材料和方法

1.1 病毒株与病料

鸭瘟病毒、鸭细小病毒、鸭圆环病毒、小鹅瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭H9亚型禽流感病毒和鸭副黏病毒由本实验室分离、保存，临床检测病料2014年采自山东省各地鸭场临床诊断为DPV感染的鸭的肝脏、脾脏等。

1.2 工具酶及试剂盒

pMD18-T载体、限制性内切酶、PCR相关试剂、DNAMarKer，DNA凝胶回收试剂盒为大连宝生物公司产品，AxyPrep体液病毒DNA/DNA小量试剂盒为爱思进生物技术(杭州)有限公司产品。

1.3 PCR引物设计与合成

参照 GenBank中登录的 DPV 基因序列（EF554403），应用PrimerPremier5.0基因分析软件，设计1对引物，扩增DPV UL30基因部分片段510bp，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。上游引物：5′-CGACTACATCCATACCCACT-3′，下游引物：5′-TATGCTTCAGCTAGAGTA-3′。

1.4 病毒基因组DNA的提取

按AxyPrep体液病毒DNA/DNA小量试剂盒使用说明书提取DPV的DNA，并提取其他几种病毒的核酸。

1.5 DPVUL30基因的PCR扩增及条件优化

以DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为25μL。各参数为95℃预变性5min，然后进入95℃30s、47℃30s，72℃30min循环，共35个循环，最后72℃延伸10min。取3μL产物，1%琼脂糖凝胶电泳，紫外成像。同时对各扩增条件进行优化，包括退火温度(43～53℃梯度温度，每2℃为1个梯度)、引物浓度(0.2～1.2μmol/L，每0.2μmol/L为1个梯度)等，反应体系均为25μL。

1.6 PCR扩增产物的检测及鉴定

首先取扩增产物3μL在1%的琼脂糖凝胶上电泳，利用凝胶成像系统扫描进行初步鉴定。然后用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。将目的片段与pMD18-T克隆载体于16℃连接过夜，转化DH5α 感受态。挑取单个的转化菌落，加LB溶液，37℃培养16h，用质粒提取试剂盒抽提质粒DNA用PCR方法进行鉴定，将阳性克隆送上海生工生物工程股份有限公司进行测序鉴定。将测序结果与参照的DPV序列同源性比较。

1.7 特异性试验

分别提取鸭细小病毒、鸭圆环病毒、小鹅瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭源H9亚型禽流感病毒和鸭副黏病毒的核酸，用已建立的方法进行扩增。

1.8 敏感性试验

提取DPV病毒DNA后定量，然后10倍梯度稀释提取的病毒基因组DNA，使其分别相当于含有10ngDNA、1ngDNA、100pgDNA、10pgDNA、1pgDNA和0.1pgDNA的含量，分别进行PCR检测，确定其敏感性。

1.9 重复性试验

用建立的PCR检测方法对鸭细小病毒、鸭圆环病毒、小鹅瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭H9亚型禽流感病毒、鸭副黏病毒、鸭瘟3份阳性病料及3份阴性病料，重复检测3次，以验证本方法的重复性和稳定性。

1.10 临床样品的检测

取疑似送检病料15份，利用建立的PCR方法进行检测，对扩增产物全部进行测序鉴定，并利用生物学软件BLAST进行序列分析。

2 结果与分析

2.1 扩增产物的检测

PCR扩增产物经过1%琼脂糖凝胶电泳，扩增产物在510bp处可见特异性DNA扩增条带，与预期大小相符（图1）。

2.2 特异性试验

利用所设计的引物及所确定的最佳反应条件分别对鸭瘟病毒、鸭细小病毒、鸭圆环病毒、小鹅瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭源H9亚型禽流感病毒和鸭副黏病毒分别进行PCR扩增。结果7个毒株中只有鸭瘟病毒能扩增出相应的片段，大小为510bp，而其他均未扩增出相应的片段（图2）。说明本研究建立的方法特异性好。

2.3 敏感性试验

取3μLPCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，分别在约510bp附近出现特异性条带，与预期产物大小相符。从结果可以看出，引物的PCR检测灵敏度可以达到1pgDNA（图3）。

2.4 重复性试验

经过3 次重复操作，结果一致，说明建立的方法是稳定、可靠的。

2.5 临床样品的检测

用建立的DPVPCR检测方法，共检测了15份在不同地方采集的鸭病料，检出阳性样品3份。

3 讨论

传统DPV诊断方法，如病毒分离鉴定、酶联免疫吸附和琼扩试验方法，操作繁琐，操作耗时长，重复性不好，限制了传统方法在实际中的应用。PCR检测方法具有检测速度快、敏感高和特异好等优势，能在数小时内检出病原。因此，建立1种快速、简单和敏感的DPVPCR检测方法十分必要。

图1PEDV扩增结果

图2 特异性试验

图3 敏感性试验

本试验对GenBank公布的DPV基因序列进行比对，发现DPVUL30基因相对比较保守，查找出其高度保守区域，参照GenBank中登录的DPV基因序列（EF554403）利用PrimerPremier5.0设计1对引物，通过PCR扩增出目的基因，连接到pMD18-T载体，送样测序，对测序结果与模板序列进行比对，其同源性为100%，对退火温度优化，发现只有当退火温度值为47℃时，才能获得较为理想的产物，即使相差2℃也不能获得理想的试验结果。对引物浓度进行优化，在引物浓度为0.2～1.2μmol/L对PCR扩增效率的影响不大，在0.6μmol/L时扩增效率相对较高，而在1.2μmol/L时扩增效率相对较差。敏感性试验结果显示，引物的检测灵敏度可以达到1pgDNA。特异性试验结果显示，本试验所建立的PCR检测DPV的方法能够扩增出510bp目的片段，而对常见的鸭病病毒如鸭细小病毒、鸭圆环病毒、小鹅瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭源H9亚型禽流感病毒和鸭副黏病毒均无扩增产物，证明本方法具有很好的特异性。用建立的DPVPCR检测方法，共检测了15份在不同地方采集的鸭病料，检出阳性样品3份。因此，本试验所建立的方法为DPV的诊断、流行病学调查等提供了1种简单、快速的分子诊断方法。

[1]殷震，刘景华.动物病毒学（第二版）[M].北京：科学出版社，1997.

[2]PlummerPJ，AlefantisT，KaplanS，eta1.Detection ofenteritisvirusbypolymerasechainreaction[J].Avian Diseases，1998，42：554-564.

[3]甘孟侯.中国禽病学[M].北京：中国农业出版社，1999，109-119.

[4]岳华，汤承，余勇，等.禽病临床诊断彩色图谱[M].成都：四川科技出版社，2002.

[5]BaudetA E R F.Mortality in ducksin the Netherlandscausedbyafiltrablevirus；fowlplague[J].TijdschrDiergeneeskd，1923，（50）：455-459.