手性高效液相色谱法测定恩替卡韦中对映异构体杂质

欧阳婷，杨小玲，麦曦，马惠玲，程帆，罗恒真，刘阳，刘斌

1.南昌大学药学院，南昌 330006；2.江西青峰药业有限公司，赣州 341000

恩替卡韦(Entecavir) 的化学名为2-氨基-9-[(1S，3R，4S)-4-羟基-3-羟甲基-2-亚甲基环戊基]-1，9-二氢-6H-嘌呤-6-酮，恩替卡韦是一种能有效抑制乙肝病毒复制的脱氧鸟嘌呤核苷类似物，可通过抑制乙肝病毒DNA聚合酶而抑制病毒DNA复制过程中的启动和延长步骤，对乙肝病毒的复制从起始阶段、逆转录期和DNA依赖性DNA合成期的三个阶段起抑制作用[1,2]。与其他核苷类化合物如拉米夫定(Lamivudine)、喷昔洛韦(Penciclovir)和洛布卡韦(Lobucavir)相比较，Enetcvair具有更高抗HBV活性(hepatitis B virus，HBV)[3]；而且长期应用耐药的发生率较低，同时还具有剂量小、安全性高等优点[4]。

恩替卡韦为手性药物，分子中有三个手性中心，其有效的构型为1S，3R，4S，但在合成过程中可能引入各种光学异构体杂质，包括非对映异构体杂质和对映异构体杂质，其主成分及主要杂质结构式见图1，非对映异构体杂质主要通过反相高相液相色谱法(RP-HPLC)进行限量检查，但是RP-HPLC难以分离对映异构体杂质，故本文建立手性高效液相色谱法检查恩替卡韦中对映异构体杂质限量的方法，为保证本品的安全性、有效性提供了方法依据。

图 1 恩替卡韦及主要光学异构体杂质结构Fig 1 The structures of entecavir and principal optical isomer impurities

1 实验部分

1.1 仪器与试药

日本岛津LC-10AT高效液相色谱仪及SPD-10A紫外检测器，正已烷及乙醇均为色谱纯，恩替卡韦对照品(纯度：99.7%，江西青峰药业有限公司提供)，恩替卡韦对映异构体对照品(纯度：99.5%，江西青峰药业有限公司)，恩替卡韦六批原料(批号分别为：20150104、20150114、20150201、20150305、20150316、20150414，江西青峰药业有限公司)。

1.2 色谱条件 色谱柱为CHIRALPAK AD-H柱(日本Daicel化学工业公司，填料为表面涂敷了直链淀粉-三[3，5-二甲基氨基甲酸酯]的球形硅胶，规格：4.6×250mm，5μm)；流动相：正己烷-乙醇(55∶45)；流速：1.0mL/min；检测波长：254nm；进样量：20μL；柱温：25℃。

1.3 溶液制备 供试品溶液：取本品约25mg，精密称定，置25m L量瓶中，加流动相适量，超声使溶解，加流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取10mL，置100mL量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，即得。

对照溶液：精密吸取1.0m L供试溶液，置100mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，即得。

对映异构体对照品溶液：精密称取对映异构体(1R，3S，4R)对照品约5mg，置100mL量瓶中，加流动相适量，超声使溶解，加流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取1.0mL，置100mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

混合对照品溶液：分别取恩替卡韦、对映异构体(1R，3S，4R)适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml中约含恩替卡韦0.1mg 和约含对映异构体(1R，3S，4R)0.5μg的混合溶液。

图 2 恩替卡韦对映异构体紫外吸收光谱Fig 2 The ultraviolet absorption spectrum of entecavir enantiomer

2 结果与讨论

2.1 测定波长的选择 取恩替卡韦对映异构体对照品溶液在200～400nm间进行光谱扫描，扫描图谱见图2，结果显示恩替卡韦对映异构体在254～256nm波长处有最大吸收，故选择254nm为测定波长。

2.2 空白溶剂试验 取流动相20μL注入液相色谱仪，按1.2项下色谱条件进行检测，结果见图3，结果表明流动相对恩替卡韦的异构体检查没有干扰。

图 3 空白溶剂色谱图Fig 3 HPLC chromatograph of blank solvent

2.3 系统适用性试验 取1.3项下的恩替卡韦、对映异构体混合对照品溶液作为系统适用性溶液，按1.2项下色谱条件进行检测，结果见图4，出峰顺序依次为：对映异构体，恩替卡韦，二者的分离度符合要求。

图 4 系统适用性试验色谱图Fig 4 HPLC chromatograph of system suitability

表 2 稳定性试验结果Tab 2 The results of stability test

2.4 检测限 取恩替卡韦对映异构体适量，用流动相溶解并逐级稀释，按3倍的信噪比计算，最低检测限为1ng。

2.5 精密度试验 取1.3项下的恩替卡韦、对映异构体混合对照品溶液20μL注入液相色谱仪进行测定，连续平行分析6次，记录对映异构体的峰面积，结果见表1，结果表明方法的精密度良好，方法可行。

2.6 稳定性试验 取1.3项下的恩替卡韦、对映异构体混合对照品溶液20μL，分别在0，1，2，4，6，8小时注入液相色谱仪，测定峰面积，结果见表2，结果表明恩替卡韦主成份和对映异构体在流动相溶液中放置8小时稳定性良好。

2.7 样品中对映异构体杂质测定 各批样品均按“1.3”项下的方法制备成供试品溶液和对照溶液，取对照溶液20μL注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成份色谱峰的峰高为满量程的10%；再精密量取供试品溶液和对照溶液20各μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液的色谱图中如有与恩替卡韦对映异构体保留时间一致的色谱峰，其峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.2倍(0.2%)。结果6批样品均未检出对映异构体杂质。

[1] Han SB. Natural course, therapeutic options and economicevaluation of therapies for chronic hepatitis B[J]. Drugs, 2006, 66(14): 1831-1851.

[2] Buti M, Esteban R. Drugs in development for hepatitis B[J]. Drugs, 2005, 65(11): 1451-1460.

[3] 陈琨, 欧阳贵平, 任志尧, 汪春梅, 杨金志. 核苷类抗乙肝病毒药物研究最新进展及其合成方法[J]. 精细化工中间体, 2008, 38(2): 17-22.

[4] Chang T T, Gish R G, Robert G G, et al. A Comparison of Entecavir and Lamivudine for HBeAg-Positive Chronic Hepatitis B[J]. New Eng J Med, 2006, 354(10): 1001-1010.

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