蜜蜂白垩病的草药防治研究

李 绚，龙敏仪

(肇庆市食品药品检验所，广东 肇庆526020)



蜜蜂白垩病的草药防治研究

李 绚，龙敏仪

(肇庆市食品药品检验所，广东 肇庆526020)

以意大利蜜蜂和蜜蜂球囊菌为主要试验材料，通过记录外界温湿度、幼虫脾的温湿度、蜂群的储蜜量和储粉量以及发病幼虫数，研究养蜂生产中白垩病发病时上述指标的变化趋势，并进行了相关性分析；以桧木、喜久二醇、黄藤碱和蛇床四种中草药制剂以及蜜蜂球囊菌为主要的试验材料，研究实验室条件下这四种中草药制剂对蜜蜂球囊菌生长的抑制作用。结果显示：试验组内，外界湿度、幼虫脾温度、储蜜量与发病幼虫数之间的相关性显著；对照组内，外界湿度与发病幼虫数之间的相关性显著；在6.5%、5.0%、3.5%、2.0%和0.5%5个浓度的药剂溶液中，喜久二醇、黄藤碱、蛇床3种中草药制剂对蜜蜂球囊菌没有抑制作用；而桧木在5.0%的溶液浓度上表现出一定的抑菌作用。结果表明，蜜蜂白垩病的发病与食物储蜜量、外界湿度和幼虫脾温度有关，而蜂群的食物储备量是导致白垩病发生的关键诱发因素；桧木中草药制剂对蜜蜂球囊菌的生长有一定的抑制作用。

白垩病；意大利蜜蜂；养蜂生产；中草药防治

蜜蜂白垩病是由蜜蜂球囊菌(Ascosphaeraapis)感染西方蜜蜂(Apismellifera)幼虫而引起的一种真菌性昆虫疾病。一些研究[1-3]认为，温度和湿度被当作诱发白垩病的关键因素，但在实际养蜂生产中发现：将蜜蜂球囊菌引入产蜜蜂群，当大流蜜季节来临时，生产群内的相对湿度非常高，有时可以高达90%，而幼虫脾上的温度有时也会降至32 ℃左右，与诱发白垩病的温度范围相吻合，但几乎没有蜂群表现出白垩病的症状。此现象说明蜂箱内(幼虫脾上)的温度或湿度并不是影响蜜蜂白垩病发病的关键因素。在总结大量研究成果的基础上推测[4-7]，只有当孢子所处的蜜蜂幼虫中肠内具备了“培养基”一样的环境，蜜蜂球囊菌孢子萌发、菌丝生长成功后，幼虫才会发病。因此，蜂群内的食物储备量才是导致白垩病发生的关键诱发因素，这是由于食物储备量不仅在很大程度上决定幼虫体内中肠环境的状态(温度、相对湿度、pH等)，而且还直接影响到工蜂震动胸肌发热的积极性，即影响幼虫生活环境的状态(温度、相对湿度、CO2等)，因而蜂群的食物储备量应该是研究的重点。

蜂群的食物储备量是导致白垩病发生的关键诱发因素，为验证本文所提出的观点，本试验以意大利蜜蜂(Apismelliferaligustica)和蜜蜂球囊菌(Ascosphaeraapis)为主要试验材料，通过记录外界温湿度、幼虫脾的温湿度、蜂群的储蜜量和储粉量以及发病幼虫数，研究了养蜂生产中白垩病发病时上述指标的变化趋势，找出其关键性诱发因素，并探讨桧木、喜久二醇、黄藤碱和蛇床4种中草药制剂对蜜蜂球囊菌生长的抑制作用和防治效果，以期为蜜蜂白垩病的防治研究提供一些参考。

1 材料与方法

1.1 试验地点

广东省昆虫研究所蜜蜂中心养蜂基地，大部分地区海拔在1 500～2 800 m之间，年平均降雨量900～1 000 mm, 年平均气温14.67 ℃。蜜源植物相对稀少，粉源植物较丰富。

1.2 试验仪器

PQX 多段可编程人工气候箱；HC 520型温湿度计；Nikon E 600数码照相机；超净工作台；平板、试管等玻璃器皿；灭菌处理的蜂刷、起刮刀、橡胶手套等。

1.3 培养基配方

采用改良的PDA+酵母浸膏真菌培养基，去皮土豆200 g；葡萄糖10 g；酵母浸膏5 g；链霉素(650万单位)0.154 g；琼脂20 g；蒸馏水1 000 mL，灭菌条件为121 ℃ 30 min。

1.4 蜜蜂白垩病病样

蜜蜂白垩病病样于2011年5月采自广东省从化县。所采病样的外部形态特征完全符合白垩病特征[3-5]。采后立即于3～5 ℃下封存备用。

1.5 供试蜂群的调整

8群试验蜂群全部为意大利蜜蜂(Apismelliferaligustica)，由广东省昆虫研究所蜜蜂研究中心试验蜂场提供。试验开始前一个月，将8群西方蜜蜂按照试验要求调整至中等群势。每群为四脾蜂，每脾上都有足量的成蜂，蜜、粉储备量及幼虫数相近。

1.6 供试中草药制剂溶液的配制

试验中所用到的四种中草药制剂桧木(缩写M，Cypress extract，240 mL/瓶，水剂)和喜久二醇(缩写X，Hei long glycol extract ，250 mL/瓶，水剂)由日本 JRJ 株式会社提供, 黄藤碱(缩写H，Daemonorops margaritae alkali extract，1 000 mL/瓶，水剂)和蛇床(缩写S，cnidium monnieri extract，1 000 mL/瓶，水剂)由购自广东肇庆制药厂。以无菌蒸馏水作为溶剂, 将中草药制剂分别配制成以下5个浓度的药剂溶液：6.5%、5.0%、3.5%、2.0%和0.5%，置于常温下备用。

1.7 方法

1.7.1 蜜蜂球囊菌的分离纯化与鉴定 对蜜蜂球囊菌进行常规的分离纯化：1)以75%的酒精浸泡病样2 min进行表面消毒，取出在无菌风中吹干。2)用无菌小刀将病样切割为2 mm的颗粒，直接点于培养基表面。3)培养皿置于智能人工气候箱中，温度30±1 ℃，相对湿度85±3%，培养时间为7～10 d。培养出的菌落为第一代。4)从第一代中挑选出典型的致病菌菌落，利用其孢子进行划线接种，培养出的菌落为第二代。5)同上步骤，培养出第三、第四和第五代菌落并完成致病菌的分离纯化程序。6)对每一代的典型致病菌菌落都要进行显微镜下观察并做记录。7)对完全纯化所得的菌株进行扩大培养，作为试验用菌种种质。

将最终分离纯化得到的十株菌株全部进行菌种鉴定。除了常规的显微镜下形态鉴定外，本试验中还采用分子生物学鉴定手段，对每株菌的ITS1-5.8S-ITS2区域进行序列测定。将其与Genbank中存储的该段序列(登陆号为U68313)进行比较鉴定。

1.7.2 养蜂生产中白垩病发病条件的监测 1)将8群西方蜜蜂随机地平均分为试验组(A)和对照组(B)；蜂群的安放地点相距100 m。2)制备蜜蜂球囊菌孢子悬液，稀释至孢子浓度为107个/mL 。3)试验开始前，给这两组的每群蜂都饲喂等量(200 mL)等浓度(1∶1)的白砂糖水，连续饲喂3 d。饲喂A组的白砂糖水中混有蜜蜂球囊菌孢子悬液；B组则混入等量的无菌水。4)最后一次饲喂白砂糖水后，对A、B两组的每个蜂群都进行抖蜂，并给每张脾的两面都拍摄清晰的图片(如下图1所示)以便精准计数各个蜂群的蜜、粉储备量和发病幼虫数。然后将HC520型温湿度计的探头附于每群蜂中脾上的幼虫区中心，以测定幼虫脾的温、湿度。外界放置同型号的温湿度计进行测定。5) 从试验开始到试验结束，每日都记录温度和相对湿度：早7:00 记录第一次，以后每隔 3 h记录一次，直到晚上22:00 时记录最后一次。6)试验开始后, 单日的午后13:05对A组的4个试验群进行开箱检查并抖蜂。当晚20:00时对B组进行饲喂, 每次饲喂200 mL 1∶1浓度的白砂糖水，双日的午后13:05时对B组的4个试验群进行开箱检查并抖蜂。当发现A组中某群的储蜜量少于100个巢房时, 当晚立即饲喂该群200 mL 1∶1浓度的白砂糖水。直至试验结束(连续监测20 d)。计数每个阶段的的蜜房数、粉房数和患病幼虫数。

图1 点药程序示意图

1.7.3 4种中草药制剂对蜜蜂球囊菌的体外抑制作用 以经过菌种鉴定的蜜蜂球囊菌作为接种源，接种出16个平板用于药物抑菌试验(重复4次)。接种致病菌孢子后将平板置于温度(30±1)℃、相对湿度(85±3)%的条件下，待其生长72 h后，运用K-B法，按照图1所示点完蘸有药剂溶液的滤纸片后，继续培养。逐日记录每个平皿中各个滤纸片的抑菌圈半径，连续记录7 d，直至菌落长满培养皿。

2 结果与分析

2.1 蜜蜂球囊菌的分子生物学鉴定

将最终分离纯化得到的10株菌株的ITS1-5.8S-ITS2区域进行分子生物学鉴定。测序结果表明，ITS1-5.8S-ITS2区域全长为590 bp(图2)。经BLAST比对, 鉴定结果全部为蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)，其Genbank中公布的蜜蜂球囊菌ITS1-5.8S-ITS2区域(GenBank Accession No:U68313)的同源性是99.56%。

图2 蜜蜂球囊菌ITS1-5.8S-ITS2区域的序列

2.2 试验期温度和湿度变化

本试验共连续监测20 d，对试验中记录的数据进行整理、汇总，分别求出A、B 2组各个时间点的平均温湿度。将外界以及A、B 2组各个时间点的平均温湿度部分列于表1。

运用SPSS13.0 对这些数据进行描述性分析，结果如表2。

表1 外界以及A、B两组各个时间点的平均温湿度Table 1 Effect of diluent on sperm motility, acrosome integrity and plasma membrane integrity

续表1

时间点Timepoints外界温度/℃OutsideTemp.外界湿度/%OutsideHumidityA组均/℃温度GroupAmeantemp.A组均/%湿度GroupAmeanhumidityB组均/℃温度GroupBmeantemp.B组均/%湿度GroupBmeanhumidity10:0017.293.033.647.034.142.013:0018.589.033.446.033.944.016:0019.190.032.949.033.546.019:0017.293.032.948.033.150.022:0016.692.032.750.033.151.010月8日Oct.8th07:0015.894.033.254.033.762.010:0016.789.033.552.034.068.013:0017.791.033.151.034.168.016:0016.981.033.049.034.264.019:0014.175.032.852.033.671.022:0013.676.032.551.033.770.010月9日Oct.9th07:0012.294.032.052.033.666.010:0012.785.032.648.033.659.013:0014.875.032.446.033.565.016:0015.082.032.052.033.364.019:0013.187.032.055.033.070.022:0012.392.031.547.032.866.010月10日Oct.10th07:0011.994.031.949.033.458.010:0012.693.032.045.033.151.013:0014.188.032.250.033.354.016:0016.280.032.751.033.557.019:0014.594.033.155.034.365.022:0013.393.032.753.034.257.010月11日Oct.11th07:0012.693.032.360.034.159.010:0015.085.032.658.034.056.013:0017.370.032.756.034.261.016:0017.076.031.858.033.858.019:0015.790.031.655.034.154.022:0014.793.030.552.033.055.010月12日Oct.12th07:0014.296.031.3956.033.649.010:0014.893.031.655.033.350.013:0020.850.032.561.032.953.016:0023.177.033.065.033.057.019:0018.682.032.358.032.955.022:0017.588.031.057.033.651.010月13日Oct.13th07:0014.192.030.05.0233.749.010:0017.177.030.558.033.252.013:0021.744.031.356.033.854.016:0029.616.031.054.034.156.019:0020.168.033.160.034.760.022:0016.288.032.556.033.857.0

表2 描述性分析结果表Table 2 Descriptive analysis of results

A 组均温度与B 组均温度之间差异极显著(P=8.66×10-15)；A 组均湿度与B 组均湿度之间差异显著(P=0.0257)。进一步作图得到温、湿度随时间点的变化曲线图3和图 4。

图3 温度随时间点的变化曲线

图4 湿度随时间的变化曲线

文中图3清楚地显示：A 组均温度普遍低于B 组，且A 组均温度的变化幅度较大，尤其在试验的最后1周，A 组4个试验蜂群在很大程度上丧失了调节群内温度的能力。而B 组均温度始终保持在正常的温度波动范围内(33.0～35.0)℃，很少出现超出此温度范围的值。从图4中可知，A、B 两组均湿度的平均值相差不大。在试验进行的中期B 组均湿度的波动曾一度很大，而A 组均湿度则始终比较平稳，呈现出与温度不同的变化趋势。从图3、图4及表1可以很直观地得出，白垩病多发季节的外界天气特征是：有时连续数日阴雨不断，全天的温度持续偏低、湿度持续偏高；有时连续数日天气晴朗，但一日之内早、晚与中午的温湿度差异极大。这与前人的研究结果及养蜂生产的实践经验相一致[2, 4, 8-9]。

2.3 温度、湿度、储蜜量和储粉量对养蜂生产中白垩病发病的影响

对表1所列的数据进一步“压缩”处理，求出各组的日均温、湿度。将A 组单日的日均温、湿度及其日平均储蜜量、日平均储粉量和发病幼虫数列于表3。将B组双日的日均温、湿度及其日平均储蜜量、日平均储粉量和发病幼虫数列于表 4。

对表3和表4中的数据分别作相关性分析，结果如表5和表6所示。从表5和表6中可以看出，不论试验组还是对照组，发病幼虫数与外界湿度的相关性都显著(P<0.05)。这与养蜂经验以及绝大多数学者的观点一致。在本试验进行的前期(10月7日～10月14日)外界连续7 d阴雨不断，造成这期间的外界湿度持续偏高。依据蜜蜂的行为特点，当外界出现连续的阴雨天气时，蜂群会停止一切外出活动，这期间蜂群没有采集花蜜、花粉回巢，必然会导致蜂群的蜜、粉储备量不足。

由此推断：外界湿度影响白垩病发病只是事实的表面现象，蜂群的食物储备量才是真正诱发白垩病的关键因素。这一点从表5中也得到了很好的证实，A组发病幼虫数与群内储蜜量的相关性极显著(P<0.01)。而 B 组发病幼虫数与群内储蜜量的相关性没有达到显著水平，可能是由于人为地饲喂蜂群使其储蜜量始终处于“充足”状态，尚未“缺”到足以诱发白垩病的程度。

2.4 4种中草药对蜜蜂球囊菌体外抑制作用

点有H、S、X 3种中草药制剂的平板中，在蜜蜂球囊菌菌落生长一周后，蘸有药剂溶液的纸片连同对照纸片完全被菌丝和孢子囊所覆盖(图 5)。且在致病菌菌落生长的过程中并没有形成抑菌圈。由此可见，在实验室条件下，这3种中草药制剂对蜜蜂球囊菌的生长没有抑制作用。5%浓度的 M 中草药制剂形成了典型的抑菌圈(图6)。求出其四个平行平板的抑菌圈半径平均值，数据列于表7。

表3 A 组的日均温湿度、储蜜量、储粉量及发病幼虫数Table 3 Daily humiture,honey store, power store and attacked larvas in group A

表 4 B 组的日均温度、湿度、储蜜量、储粉量及发病幼虫数Table 4 Daily humiture,honey store, power store and attacked larvas in group B

M 5%与对照之间的差异不显著。事实上平板培养到10 d时，当蜜蜂球囊菌菌落几乎覆盖了整个培养皿底板时，唯有点M 5%滤纸片的方向上蜜蜂球囊菌菌落现出一个明显的凹形，与图6中所示形状相似。根据表7中的数据可做曲线图7。

从图7中可以明显地看出，48～120 h之间是M中草药制剂与菌落相互斗争的阶段。对照(蒸馏水)未能给致病菌菌落以任何的抑制作用，而M 5%却在一定程度上延缓了蜜蜂球囊菌的生长，可见M对蜜蜂球囊菌的生长有抑制作用，有望将其应用于养蜂生产中。

3 小 结

蜜蜂白垩病是由蜜蜂球囊菌感染西方蜜蜂幼虫而引起的一种真菌性昆虫疾病。大量的试验研究表明：感染了该致病菌的蜜蜂幼虫不一定会发病，只有当被感染的幼虫受到某些外界环境造成的压力时，蜜蜂白垩病的症状才会表现出来[2，4，8-12]。因此该病也被称为是一种“偶然性”昆虫疾病。

本试验结果：通过实时测定温、湿度的连续变化以及储蜜量和储粉量的日变化，发现试验组内，外界湿度、幼虫脾温度、储蜜量与发病幼虫数之间的相关性显著；对照组内，外界湿度与发病幼虫数之间的相关性显著；试验组发病幼虫数与群内储蜜量的相关性极显著，对照组发病幼虫数与群内储蜜量的相关性没有达到显著水平，可能是由于人为地饲喂蜂群使其储蜜量始终处于“充足”状态，尚未“缺”到足以诱发白垩病的程度，由此推断：外界湿度影响白垩病发病只是事实的表面现象，而“蜂群的食物储备量是影响蜜蜂白垩病发病的关键因素”。同时，试验发现：桧木中草药制剂对蜜蜂球囊菌的生长有一定的抑制作用。由此可见在防治蜜蜂白垩病方面，桧木是一种很有开发应用前景的中草药。

表5 A 组各项数据的相关性分析图(皮尔森相关系数)Table 5 Correlation analysis of data in group A(Sig.2-taited)

注：**.差异极显著；*差异显著。下同。

Notes:** Marks highly significant ditference;* Marks significant difference.The same as below.

表6 B 组各项数据的相关性分析(皮尔森相关系数)Table 6 Correlation analysis of data in group B(Sig.2-taited)

图5 H 的抑菌效果 Fig.5 Antibacterial effect of H

图6 M 的抑菌效果 Fig.6 Antibacterial effect of M

表7 M 5%和对照的抑菌圈半径Table 7 Inhibition zone radius of 5% M preparations and control preparartions

注：抑菌圈半径指滤纸片边缘到菌落边缘的距离。

Notes: Inhibition zone radius was the distance from filter to bacterial colony.

图7 M 5%与对照的抑菌圈半径变化曲线Fig. 7 Inhibition zone radius change of 5% M preparations and control preparartions

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Pathogenesis Condition and Herbal Control of HoneybeeAscospherosis

LI Xuan, LONG Min-yi

(ZhaoqingInstituteofFoodandDrugControl,Zhaoqing,Guangdong526020)

Taking Italian bees and bee balloon bacteria as the main test materials, the outside temperature and humidity, the temperature and humidity of the larvae of spleen, honey and powder store and the attacked larvae number were recorded, change of the above-mentioned indicators during pathogenesis in beekeeping production studied, and their correlation analyzed by SPSS13.0. Besides, cypress, hei long diol, daemonorops margaritae alkali and cnidium monnieri herbal medical preparations and their inhibiting effect to bees balloon bacteria were investigated in laboratory conditions. Results showed that there revealed a significant correlation among the spleen temperature, humidity and larvae honey storage and number of attacked larvae in the experimental group; In the control group, the humidity and the incidence of larvae correlated significantly; In solutions with five concentration of 6.5%, 5.0%, 3.5%, 5.0% and 0.5%, heilong diol, daemonorops margaritae alkali, cnidium monnieri herbal medical preparations effected no inhibition to bees balloon bacteria; cypress displayed a certain bacteriostasis at solution concentration of 5%.The results proved that beeascopherosiscorrelated with food honey store, outside humidity and larvae spleen temperature,among which food reserves is the key to induce ascopherosis; Cypress herbal preparations exerted certain inhibitory effect to the bees balloon bacteria growth.

Ascopherosis,Apismellifera, bee keeping, herbal medicament

2014-04-24，

2014-07-07

广东省轻工业(食品工程)行业项目[粤轻鉴定(2014)6号]

李 绚(1979-)，女，广东肇庆人，工程师，主要从事食品药品检验工作。E-mail：563983393@qq.com

S811.6

A

1005-5228(2015)04-0057-08