湘西黄牛发情周期与妊娠早期孕酮变化规律研究

李 雄，雷 虹，龙 云，李昊帮，李剑波，罗 希，李 晟，燕海峰，易康乐*

(1.湖南省畜牧兽医研究所 草业与草食动物研究室，湖南 长沙 410131；2. 湖南德农牧业科技有限公司，湖南 花垣 416400；3.长沙千山畜牧服务有限公司，湖南 长沙 410144)



湘西黄牛发情周期与妊娠早期孕酮变化规律研究

李 雄1，雷 虹1，龙 云2，李昊帮1，李剑波1，罗 希3，李 晟1，燕海峰1，易康乐1*

(1.湖南省畜牧兽医研究所 草业与草食动物研究室，湖南 长沙 410131；2. 湖南德农牧业科技有限公司，湖南 花垣 416400；3.长沙千山畜牧服务有限公司，湖南 长沙 410144)

采集湘西黄牛母牛的血液样品，通过酶联免疫吸附技术检测和比较其在发情周期和早期妊娠期的孕酮(P4)水平。结果表明，湘西黄牛的发情周期中， P4浓度变化非常明显, 大致呈先上升再下降的趋势。发情前期、中期、后期和间情期P4浓度分别为8.85、0.72、1.40和9.13 ng/mL，发情中期与后期P4浓度显著低于发情前期和间情期(P<0.05)；妊娠早期的母牛，从发情配种后，血液中P4浓度缓慢升高，其中妊娠后0～10 d、11～20 d、21～30 d和31～36 d P4浓度分别为3.36、8.91、12.69和16.12 ng/mL，各阶段P4浓度差异显著(P<0.05)；发情后第21 d 、24 d、27 d和30 d，妊娠母牛血液中的P4浓度显著高于未妊娠的母牛(P<0.05)。试验表明，发情配种后20 d，妊娠母牛与未妊娠母牛的血液中孕酮含量差异明显，可作为判断是否受孕的标记因子。

湘西黄牛；妊娠早期；发情周期；孕酮

雌性动物的发情周期与妊娠主要受到神经和激素的双重调节。生殖激素作用调节生殖、妊娠全过程。研究发情周期和妊娠周期中生殖激素的变化情况对动物发情和妊娠周期的调控机制、预防和治疗生殖类疾病、提高受胎率和妊娠率等方面有很大帮助。在母牛生殖激素研究方面，研究的重点是雌激素(E2)、孕酮(P4)、促卵泡素(FSH)和促黄体素(LH)。这些激素与母牛的正常发情、排卵、受孕、妊娠等生殖活动密切相关。一般情况下，母牛发情周期中 LH浓度出现两个高峰。第一个小高峰出现在发情当天，第二个高峰出现排卵期左右。E2水平在整个发情周期内变化相对平缓。而P4浓度变化大致呈先上升再下降的趋势，具有非常明显的规律性[1]。因此，将P4作为母牛早期妊娠诊断的标记因子在理论上是可行的。

现在国内外已普遍应用孕酮检测技术来监测家畜动物的繁殖与妊娠情况[2-4]。但肉牛与奶牛的发情周期内孕酮表达水平差异很大，国内黄牛品种与国外良种肉牛品种也有差异[5-7]。针对地方肉牛品种的相关研究报道较少，对湘西黄牛本研究旨在酶联免疫吸附技术对湘西黄牛血液中孕酮含量进行测定研究，掌握湘西黄牛孕酮在体内变化规律，了解其生殖生理变化规律，为湘西黄牛早期妊娠诊断及其它繁殖状态的监控提供可靠的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验样本

确定湖南德农牧业科技有限公司湘西黄牛资源场内的湘西黄牛母牛为试验牛，并随机选择膘情适中、生殖机能正常且正处于发情期的15头母牛，对发情爬跨牛进行直检，触摸卵泡发育及排卵情况，以母牛接受爬跨，有成熟卵泡视为发情。对其中5头母牛进行适时配种。

1.2 采样方法与数量

对发情期内不同时间段的肉牛血液进行采集，采血液 10 mL。自母牛发情当天开始至第36天止，发情当天即为0 d，每隔3 d采集血样。

1.3 血清处理

所得离心管中的血液经室温静置 4 h 后，在 4 ℃冰箱中保存过夜，待血清析出后，以 1000×g 离心 20 min，吸取血清，置于 1.5 mL 离心管中，再用同一转速将分离到的血清离心 20 min，弃去沉淀, 分装标号-80 ℃保存待用。避免反复冻融。

1.4 早期妊娠检查

配种60 d后，利用超声波技术(B型超声波诊断仪VGS3000，成都伟格科技有限公司)对配种母牛进行直肠内检查，判断是否妊娠。

1.5 试验样品激素的测定

将以上处理好的样品，利用酶联免疫吸附技术检测采集的整个发情期内血清中P4含量的变化规律，在湖南省畜牧兽医研究所草业草食动物研究室生理生化实验室进行分析，所用P4ELISA 试剂盒武汉优尔生科技股份有限公司产品。

1.6 数据处理与分析

数据以平均值±标准差(Mean ± SD)表示，采用生物统计软件SPSS 11.5进行处理分析。均值显著性分析采用Duncan法多重比较。

2 结果与分析

2.1 发情周期中不同阶段孕酮水平检测

由表1知，在湘西黄牛整个发情周期中，发情前期的P4浓度为8.85 ng/mL，发情中期的P4浓度为0.72 ng/mL，发情后期的P4浓度为1.4 ng/mL，间情期的P4浓度为9.13 ng/mL。其中发情中期与后期P4浓度差异不显著(P>0.05)，发情前期和间情期P4浓度差异不显著(P>0.05)，发情中期与后期P4浓度显著低于发情前期和间情期(P<0.05)。

2.2 妊娠早期孕酮水平检测

由表2知，在妊娠早期的湘西黄牛母牛，从发情配种后，0～10 d，P4浓度为3.36 ng/mL；11～20 d，P4浓度为8.91 ng/mL；21～30 d，P4浓度为12.69 ng/mL；31～36 d，P4浓度为16.12 ng/mL。各阶段P4浓度差异显著(P<0.05)。

表1 湘西黄牛母牛发情周期血液中孕酮水平Table 1 Concentration of progesterone in female Xiangxi cattle estrus cycle

注：同行肩标不同小写字母者表示差异显著(P<0.05)。下同。

Notes:Means with lowercase superscripts in the same row indicate significant difference(P<0.05).The same as below.

表2 湘西黄牛母牛妊娠早期血液中孕酮水平Table 2 Concentration of progesterone in female Xiangxi cattle estrus cycle

2.3 孕酮水平的变化规律

由图1知，在湘西黄牛整个发情周期中，P4浓度变化非常明显。大致呈先上升再下降的趋势。发情当天，P4浓度最低，为 0.36 ng/mL。然后显著上升，第12天达到最高值14.85 ng/mL。随后快速下降，至发情前期，回落到1.00 ng/mL左右。第24天后，P4浓度又逐步升高。妊娠早期的母牛，从发情配种后，血液中P4浓度缓慢升高。第21天时，为11.10 ng/mL，第36天时，达到16.38 ng/mL。

由图2可知，发情后第21天 、24天、27天和30天，妊娠母牛血液中的P4浓度依次为11.10 ng/mL、12.32 ng/mL、13.05 ng/mL和14.29 ng/mL，显著高于未妊娠的母牛血液中的对应浓度1.07 ng/mL、0.67 ng/mL、2.45 ng/mL和7.12 ng/mL(P<0.05)。

图1 血清中孕酮水平变化曲线Fig.1 Serum progesterone variation curve in Xiangxi cattle

图2 发情后21～30 d血清中孕酮水平比较Fig.2 Serum hormone levels comparison in 21～30 d after estrus

3 讨 论

3.1 湘西黄牛发情周期血液中孕酮水平变化

一般而言，母牛在发情排卵后，在LH的作用下，颗粒细胞黄体化形成黄体组织，孕酮分泌量逐步增加。一般在排卵后的8 d～10 d(发情后的10～12 d)，血液中孕酮浓度会达到一个峰值。此后，由于FSH的作用，周期性黄体开始退化，孕酮水平逐渐下降。在排卵前后达到一个最低阈值[8-10]。在本研究中，湘西黄牛母牛血液中孕酮水平大致符合这一规律。在发情当天，孕酮水平平均达到0.36 ng/mL，发情后12 d达到14.85 ng/mL。但是从检测数据发现，发情间期孕酮最大值达到了14.85 ng/mL，要高于王宏娟报道的荷斯坦奶牛、西门塔尔牛[11]，与谢炳坤报道的广西本地黄牛水平接近[12]。这可能是本研究所用的试验动物全程采取放养或半放养模式造成的。在全舍饲养殖模式下，母牛每日采食的精料可能较多，摄入的蛋白能量水平较高。高蛋白饲料的摄取，会造成母牛体内尿素氮和其它氮代谢产物浓度升高。高浓度的尿素氮将阻碍促黄体素与卵巢组织上特异性受体的结合，导致体内孕酮含量降低。而其它的氮代谢产物具有一定的毒性，可能会降低机体对能量的利用率，阻碍孕酮的分泌[13]。自然放牧或半放养状态下母牛主要以青绿饲草为主，所以母牛血清中孕酮水平可能更高。

3.2 湘西黄牛妊娠早期血液中孕酮水平变化

在母牛受孕后，形成妊娠黄体。妊娠早期的黄体细胞、中后期的胎盘都会产生孕酮。孕酮主要作用于子宫，抑制子宫内膜和子宫肌收缩，维持孕卵着床和妊娠过程。一般从妊娠后血液中孕酮的水平会持续升高，直至临产前差下降[14-16]。在本研究中，在湘西黄牛母牛妊娠早期，血液中的孕酮含量持续升高，每个阶段的水平量差异显著。在第36 d，达到了达到16.38 ng/mL。

3.3 孕酮作为早孕标记因子的可行性

湘西黄牛是巫陵牛的一个品系，属役肉兼用型牛，主产于湖南省湘西土家族苗族自治州以及桑植、慈利、石门、新晃、芷江、麻阳、桃源等县部分地区，湘西黄牛是我国长江以南地区所有地方品种中个体最大、适应能力强、早熟、产仔性能好、生长速度较快、肉质味美、皮张质地好的优势资源[17]。从20世纪80年代开始，由于没有科学的选种选配，近亲交配现象普遍存在，致使湘西黄牛品种严重退化。因此，湘西黄牛的品种提纯复壮和快速扩繁工作显现十分紧迫。而湖南省的肉牛业生产水平还很低，刚刚开始由传统的耕牛饲养向现代肉牛业转型，还没有形成真正意义上的肉牛业，在发展过程中还存在着许多问题。在实际的肉牛养殖中，由于失配、误配、胚胎早期死亡(流产)和屡配不孕等原因，造成了我省大量能繁母牛的空怀期延长，降低母牛的繁殖率和利用效率，从而严重阻碍湖南省肉牛业的发展[18-19]。因此，本研究通过研究湘西黄牛孕酮体内变化情况了解其生殖生理变化规律，为湘西黄牛早期妊娠诊断及其它繁殖状态的监控提供可靠数据。

通过对湘西黄牛母牛血液中P4含量的跟踪检测，发现发情后第21天 后，妊娠母牛血液和尿液中的P4浓度显著高于未妊娠母牛(P<0.05)。说明P4可以作为一个判断湘西黄牛早期妊娠的一个标记因子应用母牛的早期妊娠诊断[18]。

但在研究过程中，我们发现湘西黄牛妊娠母牛在自然发情未孕过程中，血液中的P4浓度最高值超过了10 ng/mL，显著高于其它大型牛品种[11,20-21]。而现在市场上出售的以孕酮为标记的早孕检测试纸条的阈值为10 ng/mL。因此，采用现有的成品早孕检测试纸条检测湘西黄牛配种母牛，极容易出现假阳性，从而影响母牛的发情观察和配种工作。因此，以孕酮为标记蛋白进行早期妊娠检测时，需要对胶体金试纸条的检测阈值进行调整。且需要针对血清和尿液等不同检测样品来源，进行阈值分类和细化，只有这样才能保证检测的准确性。

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Progesterone Concentration Change of Xiangxi Cattle in the Estrous Cycle and Earlier Gestation

LI Xiong1, LEI Hong1, LONG Yue2, LI Hao-bang1, LI Jian-bo1, LUO Xi3,LI Sheng1, YAN Hai-feng1, YI Kang-le1*

(1.Prataculture&HerbivoreLaboratory,HunanInstituteofAnimalandVeterinaryScience,Changsha,Hunan410131,China；2.HunanDenongAnimalHusbandryTechnologyCo.Ltd.,Huayuan,Hunan416400,China；ChangshaQianshanAnimalServiceCo.Ltd.,Changsha,Hunan410144,China)

Blood samples were collected from female Xiangxi cattle to detect and compare concentrations of progesterone during the estrous cycle and early pregnancy by ELISA. The results showed that during the estrous cycle in female Xiangxi cattle, the concentration of progesterone changed significantly with a trend from increase to decrease. In proestrus, estrus, metestrus and diestrus, the concentration of progesterone in blood samples were 8.85, 0.72, 1.40 and 9.13 ng/mL. The level of progesterone in estrus and metestrus were lower than that in proestrus and diestrus. During the early pregnancy of female Xiangxi cattle, the concentration of progesterone increased. In 0～10 d, 11～20 d, 21～30 d and 31～36 d after pregnancy, the concentration of progesterone were 3.36, 8.91, 12.69 and 16.12 ng/mL. The level of progesterone were significantly different in different stages. The progesterone of pregnant cows blood was significantly higher than non-pregnant cows 21 days, 24 days, 27 days, 30days in estrous (P<0.05). The progesterone in urine was significant higher than non-pregnant cows 20 days, 25 days, 30 days, 35 days in estrous (P<0.05). After 21 days in estrous, the progesterone in blood and urine had significant difference between pregnant cows and un-pregnant cows, being an indicator of pregnancy.

Xiangxi cattle;estrous cycle;earlier gestation;progesterone

2014-11-18

2015-03-09

湖南省科技计划重点项目(2012NK2014)；湖南省科技计划一般项目(2014NK4103)；长沙市科技计划重点项目(K1104131-21)

李 雄(1981-)，男，湖南岳阳人，助理研究员，主要从事草业与畜牧科学。E-mail:10782328@qq.com

*[通讯作者] 易康乐(1980-)，男，湖南永州人，副研究员，硕士生导师,主要从事动物繁殖生物技术。E-mail: yikangle@yeah.net

S811.6

A

1005-5228(2015)05-0055-04