比较不同方法对新疆部分地区家畜布鲁氏病菌种鉴定

多里坤·努尔沙发 米吉提·莫合他尔汗 阿曼古力·马木提

(新疆维吾尔自治区动物卫生监督所 新疆 乌鲁木齐 830011)

布鲁氏菌病是世界范围内广泛流行，尤其是对以畜牧业为主的发展中国家造成较大危害的重要人畜共患病［1］。传统病原学方法在布鲁氏菌病的诊断确诊中是金标准、该方法以较高的特异性能够鉴别不同种型的同时，还能确定疫区和传染源，但与PCR 方法比较，前者在耗时、操作安全性、敏感性等方面有明显差异。PCR 方法在布病病原学检测领域中的成功利用，在一定程度上克服传统方法的上述缺点的同时提高了布鲁氏菌株种、属性鉴定水平，而PCR 方法有抗原不稳定等缺点。为此我们设计运用细菌分离加分子生物学的病原学检测方案，对我区部分地区的牛、羊布鲁氏菌菌种进行鉴定，同时了解不同菌株在不同动物间是否存在菌种转移情况，达到通过特异、敏感、安全、快速的检测方法，确诊菌株，实施科学预防措施为目标，开展了此次检测鉴定工作，具体检测鉴定结果回报如下。

1.材料与方法

1.1 检测病料及有关数据

在新疆南北疆设3 个未布病疫苗免疫采样点共收集病原学组织(牛、羊流产胎儿)病料263 份，其中羊流产胎儿223 份、牛流产胎儿40 份。流产胎儿所属畜主、饲养家畜、孕畜、流产、布病免疫情况及家人身体状况等数据信息以填表的方式记录保存。

1.2 试验材料

1.2.1 主要试剂

琼脂粉;胰蛋白示(TRYPTOSE);布鲁氏菌试管凝集试验阳性、阴性血清由哈药集团生物疫苗有限公司购置;VirB8 - PCR 试剂及AMOS -PCR 试剂由新疆畜牧科学院兽医研究所提供。

1.2.2 仪器耗材

生物培养箱;玻璃干燥缸;PCR 仪;电泳仪;图像分析仪;一次性培养皿;蜡烛;移液枪头;微量加样器等。

1.3 方法

1.3.1 布鲁氏菌的分离培养

无菌取牛、羊流产胎儿，肝、脾、胃液等组织及胃内容，其中每份牛犊组织病料同时开展需氧和厌氧培养，而羔羊组织病料只进行需氧培养［2］，37℃培养7 天，观察菌落生长情况。挑取可疑菌落、用布鲁氏菌阳性、阴性血清进行凝集试验，对在阳性血清中凝集的可疑菌株，进行进一步纯化培养，对纯化可疑菌株、采用分子生物学PCR 方法进行分析鉴定。本试验是用PCR 鉴定试验代替传统布鲁氏菌病细菌学分离鉴定方法中的生化鉴定试验，即不开展硫化氢产生、染料抑菌、单项特异血清A、M 及粗糙R 血清凝集、噬菌体裂解试验等生化试验。

1.3.2 PCR 方法

取上述细菌学方法分离的可疑菌株，用布鲁氏菌VirB8 -PCR 和AMOS-PCR 两种方法不同的试剂按说明进行试验。

2.结果

2.1 布鲁氏菌可疑菌株的分离

细菌学分离方法共分离20 株可疑菌株，其中从羊流产胎儿中分离到11 个株菌，牛流产胎儿中检出9 个株菌。

2.2 VirB8 - PCR 和AMOS-PCR 试验结果

从上述20 株可疑菌中，VirB8 - PCR 方法检出了19 株布鲁氏菌(见图1 部分菌)，但是该试剂不能鉴别该菌的种属，AMOS -PCR 方法检出16 株布鲁氏菌(见图2 部分菌)，同时该试剂能鉴别牛种和羊种布鲁氏菌，其中9 株羊流产胎儿分离菌株均为羊种布鲁氏菌，7 株牛分离菌株均为牛种布鲁氏菌，羊种布鲁氏菌感染率为3.4%、牛种布鲁氏菌感染率为2.6%。检测结果显示不同畜间未发现布鲁氏菌菌种转移现象。细菌学方法及两种PCR 方法鉴别结果的对比，详见表1 和图3。VirB8 - PCR 布鲁氏菌均出现的扩增带为716bp，AMOS -PCR 牛种、羊种布鲁氏菌均出现的扩增带分别为498bp 和731bp。

图1 6 株分离可疑菌株

AMOS- PCR 扩增结果M:Marker.1:羊流产胎儿中分离可疑菌株:1#、2#、3#、4#、5#、6#、8#.牛流产胎儿中分离可疑菌株7#、9#.

表1 细菌学方法及两种PCR 方法鉴别结果的对比表

图3 细菌学方法及两种PCR 方法鉴别结果的对比图

3.讨论分析

3.1 布鲁氏菌病的病原学检测在布病疫情判断，成功实施有效防制措施等方面最可靠和重要方法之一。布鲁氏菌病细菌学检测方法虽然能从被检病料中直接检出致病菌，还能进行菌性鉴定和鉴别种、属，但所需时间较长、比较繁琐，条件苛刻，检出阳性率较低［3］，生物安全性差，实验人员需进行严格培训才能操作，因此上述该方法在逐步退出检测方法行列之中［4］。综合上述因素，本实验对细菌学方法进行简化，用特异、敏感、相对安全、快速的［5］PCR 方法代替细菌学生化鉴定。两种PCR 方法中VirB8 - PCR 方法较敏感，检出率高，但只能鉴别布鲁氏菌、不能种属区分，而AMOS-PCR 方法检出率低，显示特异性高，且能鉴别种属，所以AMOS-PCR 方法推广运用的价值较高。

3.2 试验鉴定确诊此次引起该流产的病因是牛感染牛种和羊感染羊种布鲁氏菌。三种试验的出菌率方面;细菌学方法疑似布鲁氏菌出菌率为7.6%，VirB8 - PCR 为7.2%，AMOS -PCR 为6.08%。AMOS -PCR方法，在出菌率方面比细菌学方法底1.52 百分点，比VirB8 - PCR 底0.4个百分点。细菌学方法与VirB8 - PCR 及AMOS-PCR 方法的符合率，分别为95%和80%。VirB8 - PCR 及AMOS -PCR 的特异性、比细菌分离方法分别高5 个百分点和20 各百分点，相对而言、特异性最高的是AMOS-PCR 其次是VirB8 - PCR 和分离方法、敏感性相反。对于AMOS -PCR方法未能检出的4 株菌归属问题，在以后的工作继续细菌学生化鉴定，并且与其它方法对比试验后、给予评价。AMOS -PCR 方法虽然在特异、便利、安全及快速等方面高于其它两种方法，但是敏感性需要进一步评价。布鲁氏菌患病畜群及时进行全检、检出阳性畜按有关规定处理后，未感染家畜进行疫苗接种，是保护人类健康、减少经济损失、在畜间最终根除该病的最有效的方法和必要措施之一［6］。

3.3 为了更好地了解我区家畜布病发病情况和制定有效预防措施，今后的检测工作中，需进一步加大病原学检测工作。开展有针对性的防疫工作的工作中，利用分子生物学方法对分离菌株的基因序列进行分析，准确掌握菌种特征，为各类预防措施的及时顺利开展，提供科学数据。

［1］ Marta A，Almiron Norberto，Sanjuan.The Aggregation of Brucella abortus Occurs Under Microaerobic Conditions and Promotes Desiccation Tolerance and Biofilm Formation［J］，Open Microbiol J.2013，7:87-91..

［2］ 李长友，李明，马世春等.动物布鲁氏菌病防治指导手册［M］.中国农业出版社出版，2012，第一版，第二章，弟一节.

［3］ 李坚，李铁锋，王艾琳.用PCR 方法对布鲁氏菌进行筛查及分型鉴定的研究［J］.中国地方病防治杂志，2009，24(6):300.

［4］ 张芳，钱爱东.布鲁氏菌诊断学研究进展［J］.吉林畜牧，2011，01，274(32):10.

［5］ 姜海，崔步云，AMOS-PCR 对布鲁氏菌种型鉴定的应用［J］.中国人兽共患病学报，2009，(25):107.

［6］ XinghongYANG，Jerod A .SKYBERG，LingCAO.Progress in Brucella vaccine development［J］.Front Biol (Beijing).2013，8(1):60 -77.