猪瘟、猪口蹄疫、猪繁殖与呼吸综合征三种疫苗同时免疫对公猪精液品质影响的研究

王建明

（甘肃省庄浪县畜牧兽医局，甘肃 庄浪744699）

为探讨猪瘟（CSF）、猪口蹄疫（FMD）、猪繁殖与呼吸综合征（PRRS） 三种疫苗同时分点免疫对种公猪精液品质的影响，以期减少精液生产中因免疫产生不良影响的频次和持续时间优化公猪免疫程序，保证精液质量。

1 材料

1.1 试验猪只选择 庄浪县金锁生猪养殖有限公司、恒达生猪养殖有限公司、良邑乡良怡种公猪站选取杜洛克、长白、大约克3个品种且实验前精液品质符合（GB/T25172-2010《猪常温精液生产与保存技术规范》）要求的各项指标。

1.2 疫苗选择 猪 0 型口蹄疫合成肽疫苗（2570+7309），申联生物医药(上海)有限公司，批号：20140311001;猪瘟活疫苗（细胞源），中牧实业股份有限公司江西生物药厂，批号：201404062;猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗（NVDC-JXA1株)洛昭普莱柯生物工程股份有限公司，批号：20140602。

1.3 仪器设备 精子密度仪、显微镜（带恒温载物台）、电子天平、恒温水浴锅、美兰染色液、计数器、、血球计数板、血盖片、微量移液器、擦镜纸、吸水纸、玻璃棒、捕猪器、注射器、真空采血管、量杯、量筒、美兰染液、95%酒精、3.0%氯化钠溶液、去离子水、75%酒精等。

2 方法

2.1 试验猪分组及免疫方法 按品种选试验猪30头，分为3组：第1组（杜洛克组），10头，编为D1-D10；第2组（长白组） ,10头，编为C1-C10；第3组（大约克组） ,10头编为Y1-Y10。

以上各组均口蹄疫合成肽疫苗颈部左侧肌肉注射,猪瘟活疫苗颈部右侧皮下注射,猪蓝耳病疫苗于臀部肌肉注射,各种疫苗均按照使用说明书规定的剂量注射，规范操作。

各组免疫接种后临床观察24小时,免疫后每过6小时记录观察结果1次,重点观察是否出现食欲减退、发热、精神颓废等轻微症状和死亡、流产、过敏性休克等强烈反应，同时备好地塞米松、肾上腺素等急救药物，以防止试验猪死亡。

2.2 免疫抗体监测 免疫后第28天采集血清送庄浪县疫控中心实验室进行抗体检测，猪瘟免疫抗体检测采用正向间接血凝试验，猪O型口蹄疫合成肽疫苗和猪蓝耳疫苗免疫抗体检测采用间接ELISA法。

2.3 精液品质监测 在同时免疫CSF、FMD、PRRS疫苗前，以上各组每3天采集一次精液并进行精液品质监测，共连续监测20次。各组免疫后每3天采集一次精液并进行精液品质监测，同样连续监测20次，主要监测采精量、精子活力、精子密度、精子畸形率4个指标。

2.3.1 采精量监测 为减少实际操作中因部分玻璃量具导致的误差，每次精液采集完毕，及时过滤，再用电子天平称取重量，按1g≈1m l换算体积。

2.3.2 精子活力监测 取刚采鲜精，分别用微量移液器取25μl置于载玻片上并加盖玻片，置于37℃恒温载物台上，用显微镜400倍观察精子活力，每样片观察3个视野，并观察不同液层内的精子运动状态，进行计算。三个视野活力检测的平均数按照M=(n1+n2+n3)/3式中：M--活力，%；n1--第一视野活力，%；N2--第二视野活力，%；N3--第三视野活力，%。

2.3.3 精子畸形率检测 取精液一滴滴于载玻片一段，用另一边缘光滑的载玻片与有样品的载玻片一段呈45°夹角，将样品均匀的涂布于载玻片上，自然风干，每个样品制作3个抹片；待风干后，将抹片侵入无水酒精中固定2～3min，取出风干；在风干的抹片上滴加美兰染液2 3m l，染色3min；用蒸馏水冲洗干净，风干；置于显微镜400～600倍下观察200～500个精子，计算精子畸形率。计算方法：A=A1/A2×100%式中：A--畸形率，%；A1--畸形精子数，个；S--精子总数，个。

2.3.4 精子密度监测 使用法国大欧公司CRYO-VET精子密度仪进行检测，具体操作方法：按ON/OFF键打开机器；把加有精液稀释液的参考样品加入检测杯内，按下松开“R”键，密度仪显示0.00，此时精子密度仪归零，取出参考样品；再用另一只干净量杯加入5ml新鲜精液进行测量；按下松开“T”键,显示屏显示所测量精液的吸光度，然后查随机附带的《猪精液吸光度-密度转换表》即可检出该精液的精子密度。

2.3.5 结果统计与分析方法 精液品质检测的每项指标在免疫前和免疫后各有20个数据,然后将各项监测数据按品种不同分免疫前和免疫后，用SPSS软件进行方差分析与显著性检验，在分析比较时用平均值(X)±标准差(SD)表述,用单因素方差分析法检验免疫前后各监测指标间的差异显著性。

3 结果与分析

3.1 免疫应激反应观察结果 按上述方案免疫后，均未出现强烈应激反应。只有杜洛克组有1头猪在注射疫苗6小时后出现轻度减食（副反应率0.67%） 经一段时间后恢复正常。因此说明三种疫苗同时免疫副反应发生较低。

3.2 同时免疫CSF、FMD、PRRS后抗体检测结果 免疫后第28天检测CSF、FMD、PRRS三种疫苗免疫抗体，均达到农业部要求的合格率70%以上。这可能与所选公猪免疫前基础抗体的存在有关。

表1： 三种疫苗同时免疫后第28 天抗体合格率

3.3 采精量监测结果 3个品种公猪注射疫苗前后精液量比较见表2。试验结果表明，大约克种猪三种疫苗同时多点免疫后采精量显著降低（P＜0.05），而长白和杜洛克猪在注射前后精液量无显著差异。

表2： 3 个品种公猪注射疫苗前后精液量比较

3.4 活力监测结果 活力监测结比较发现，3个品种公猪在疫苗注射前后精子活力差异均不显著（P＞0.05）。

3.5 畸形率监测结果 3个品种公猪注射疫苗前后精子畸形率比较发现，大约克 长白 杜洛克三个品种公猪在同时免疫CSF、FMD、PRRS疫苗后精子畸形率显著增加（P＜0.05），其中:大约克的畸形率增加了36.0%,直到免疫后第8次监测（免疫后27天） 逐渐恢复至免免疫前水平;长白的畸形率增加了38.4%，直到免疫后第10次监测（免疫后33天） 逐渐恢复至免免疫前水平；杜洛克畸形率增加了33.9%,直到免疫后第9次监测（免疫后30天） 逐渐恢复至免免疫前水平。

表3： 3 个品种公猪注射疫苗前后精子活力比较

表4： 3 个品种公猪注射疫苗前后精子畸形率比较

3.6 密度监测结果 3个品种公猪注射疫苗前后精子密度比较发现，3个品种公猪在疫苗注射前后精子密度差异均不显著（P＞0.05）。

表5： 3 个品种公猪注射疫苗前后精子密度比较

4 讨论

在猪的常温精液生产中，采精量、精子活力、密度、畸形率是评价原精液是否合格的重要指标，根据本研究3种疫苗同时免疫后公猪精液品质持续监测结果可以看出：长白与杜洛克采精量在免疫前后表现平稳，前后差异不显著（P＞0.05），这与张淑二[[[]张淑二，林雪，刘栋，等.注射口蹄疫疫苗对不同肉用品种种公牛精液品质的影响[J]中国草食动物.2011,31（4）：23-25.]]等人在O型口蹄疫疫苗免疫牛上的试验结果一致，大约克猪在免疫前后采精量变化显著（P＜0.05），这与瞳敬宾的研究，大约克猪在注射疫苗前后的精液量差异显著（P<0.05），其他各品种注射前后差异精液量差异不显著的结论完全一致[[[]佟敬宾.注射疫苗对种公猪精液品质的影响[J]猪业科学.2008,9:94-95.]]。这说明3种疫苗同时免疫对公猪采精量有一定影响。

精子活力和密度在3种疫苗免疫前后各品种变化均不显著（P＞0.05） 这与汪泽华的研究，猪瘟疫苗引起的精子活力下降至10天后开始恢复，至14天完全恢复的结论不一致[[[]汪泽华.常规免疫注射对公猪精子活力的影响[J]河北畜牧兽医.2002,18（3）：19.]]，究其原因，可能是他的研究使用2种以上的灭活疫苗所致。

精子畸形率在3种疫苗同免疫后较免疫前有明显增高（P＜0.05） 但是均没有超过畸形率≤20%这一国家标准。

综上，3种疫苗同时免疫后，公猪精子畸形率明显增加，大约克采精量明显下降，究其原因，是因为灭活疫苗生产中加入的氢氧化铝等佐剂对猪体细胞的生物毒性引起。所选种公猪在免疫后第28天的抗体检测中，各品种均表现出了较好的抗体水平是由于免疫CSF、FMD、PRRS疫苗前前一次免疫抗体存在所致。

根据(GB23238-2009《种猪常温精液》 )对用于生产常温精液的原精液要求是：采精量≥100ml、精子密度≥1亿/ml、精子活力≥70%、精子畸形率≤20%，外观乳白色，无脓性分泌物，无皮毛等异物，结合本试验可知在种公猪的免疫上可以采用3种疫苗同时免疫。

5 结论

猪瘟活疫苗（细胞源）、猪口蹄疫O型合成肽疫苗、猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗（NVDC-JXA1株） 三种疫苗同时分点免疫种公猪，精子畸形率在免疫后有显著上升，但精液品质符合常温精液产品要求，并没有超过国家标准，该方法能有效降低因免疫对精液品质造成的不良影响，减少影响频次，缩短影响周期。在种公猪的免疫上是安全可行的。

[1] 张淑二，林雪，刘栋，等.注射口蹄疫疫苗对不同肉用品种种公牛精液品质的影响[J]中国草食动物.2011,31（4）：23-25.

[2]佟敬宾.注射疫苗对种公猪精液品质的影响[J]猪业科学.2008,9:94-95.

[3]汪泽华.常规免疫注射对公猪精子活力的影响[J]河北畜牧兽医.2002,18（3）：19.