熟蛋壳膜微观形貌及其拉曼光谱分析

狄 伶

(上海交通大学 分析测试中心，上海 200240)



熟蛋壳膜微观形貌及其拉曼光谱分析

狄 伶

(上海交通大学 分析测试中心，上海 200240)

为了有效利用熟蛋壳膜，初步检测了其微观形貌和表面分子基团,评价其回收可利用性。模拟烹调工艺，制备熟蛋壳膜；使用扫描电镜观察熟蛋壳膜微观形貌；使用拉曼光谱仪检测熟蛋壳膜表面分子基团。实验结果显示：熟蛋壳膜在经过高温烹煮后仍然保持纤维网状结构。壳膜纤维轻微溶胀，但未塌陷成片。熟蛋壳膜表面分子基团拉曼光谱信号减少，蛋白质主要发生构象改变。初步推断熟蛋壳膜具有可回收可利用性。

熟蛋壳膜； 拉曼光谱； 微观形貌

0 引 言

人们在日常生活中发明了很多食用鸡蛋的方法，其中最简单、营养价值获取率最高的为煮鸡蛋[1]，因此熟鸡蛋壳在废弃蛋壳中占有相当的比例。我国是禽蛋产业大国，每年的禽蛋产量高达数千万t，相应产生的废弃蛋壳高达数百万t。这些弃置蛋壳直接造成了环境的污染和资源的浪费。目前，对废弃蛋壳的综合利用正逐渐受到海内外学者的广泛关注[2-3]。

鸡蛋由外至内依次是蛋壳、蛋壳膜(Eggshell Membranes，EM)、蛋清和蛋黄。由此在各组分间形成3个界面，分别是：①蛋壳与蛋壳膜的界面；②蛋壳膜与蛋清的界面；③蛋清与蛋黄的界面。我们在分析蛋壳膜时，定义其壳面，即与蛋壳的界面为外壳膜(Eggshell Membranes Towards Eggshell，EMEs)；定义其蛋面，即与蛋清的界面为内壳膜(Eggshell Membranes Towards Egg，EME)[4]。蛋壳富含碳酸钙(约93%)，外形圆润质地坚硬；蛋壳膜富含蛋白质(约90%)，质地柔软具有通透性，两者共同包绕保护卵内容物[5-6]。蛋白质在一定的物理、化学因素作用下，会发生空间构象改变，从而引发理化性质的改变和生物活性的丧失，这种现象即是蛋白质变性[7]。研究发现，鸡蛋在沸水中烹煮超过10 min，内部会发生一系列的理化变化(这种过程即热变性)，然而变性的蛋白质更易被人体的消化酶分解，利于吸收[8]。

熟蛋壳膜富含蛋白质，经过烹煮工艺也发生热变性。为了有效利用熟蛋壳膜资源，我们使用扫描电镜观察熟蛋壳膜(Cooked Eggshell Membranes，CEM)的微观形貌，并对其表面分子基团进行拉曼光谱检测，初步分析熟蛋壳膜的回收可利用性。

1 实验部分

(1) 材料与设备。材料：取市售草鸡蛋待用。设备：低真空超高分辨场发射扫描电子显微镜(型号Nova NanoSEM 230，美国FEI公司)；离子溅射仪(型号E-1045，日本Hitachi公司)；色散型共聚焦拉曼光谱仪(型号Senterra R200-L，德国Bruker Optics公司)。

(2) 实验方法。样品的前处理：将洗净的鸡蛋放入水中浸泡1 min(防止蛋壳煮爆)，小火煮沸后温火煮8 min。捞出煮熟的鸡蛋在冷水中浸泡0.5 min，以便于剥离出蛋壳膜。熟蛋壳膜室温干燥并保存。

电镜观察前使用离子溅射仪对待测面进行喷金以降低生物样品由于不导电而产生的荷电现象，喷金条件：15 mA，30 s(10 nm/min)；扫描电镜参数：Accelerate voltage， 5 kV。

拉曼光谱检测参数：激发器波长为785 nm；激光功率100 mW；曝光时间和累积次数分别为2 s和2；光谱分辨率9 cm-1；实验采集的波数范围为250～3 300 cm-1；原始光谱数据使用拉曼光谱仪自带软件OPUS 7.2作图，对光谱数据进行主成分分析。

2 实验结果与讨论

在前期工作中，我们使用扫描电镜观察了蛋壳及壳膜的微观形貌[4]。蛋壳膜与蛋清相交处为一层纤维混蛋清结构，由黏稠蛋清侵入蛋壳膜，受蛋壳膜多层纤维阻滞而成。在分离蛋壳膜时，蛋面的断裂处主要产生在蛋清处，因此蛋壳膜的蛋面是一个相对光滑的表面。观察到在与细胞共培养时，正是这种表面很难使细胞黏附于其上。然而，蛋壳膜的壳面断裂处主要在蛋壳膜纤维处，因此暴露出大量的纤维网状结构(偶见脱落的蛋壳碎片)。

我们观察到熟蛋壳膜的微观形貌：①其壳面有较明显的溶胀、塌陷现象(如图1B)，这与生蛋壳膜遇水溶胀后的结构相似，但溶胀程度有所不同。推测溶胀在一定温变范围内比较迅速，随着蛋白质构象的改变，溶胀趋势有所减缓。因此形成的纤维网状结构塌陷程度较低，并未完全塌陷成片呈封闭状态；②熟蛋壳膜蛋面的微观形貌比生蛋壳膜的更加粗糙(如图1c，C)。我们推测这是由于水蒸汽分子在界面处的流通增加了界面的粗糙度。综上：从熟蛋壳膜的微观形貌来看，熟蛋壳膜保留了生蛋壳膜的多层纤维网状结构，尽管发生了一定程度的溶胀和塌陷，并不影响自有结构的保持。而熟蛋壳膜蛋面粗糙度的增加，我们认为这种微观形貌也许更利于细胞黏附。

(a,b,c)生蛋壳膜(A,B,C)熟蛋壳膜

图1 蛋壳膜的微观形貌

蛋白质在加热过程中维持蛋白三级结构的疏水键和氢键被破坏，亚基肽链结构趋于松散，但并不导致蛋白质肽键断裂[8-9]。加热超过100℃，蛋白质分子双螺旋结构开始展开，其二、三级结构(α-螺旋、β-折叠、β-回旋随机卷曲结构)随之发生改变，其中α-螺旋明显减少；加热至120 ℃，蛋白质分子充分展开。

壳膜富含角蛋白，角蛋白的主要成分是含巯基的半胱氨酸(Cys)[10]。加热使半胱氨酸链上的二硫键断裂、硫基被氧化[11]。半胱氨酸包含3种骨架结构，C-C-N骨架振动出现在366 cm-1，C-C-S骨架变形出现在215 cm-1和98 cm-1。结合我们前期对蛋壳膜的拉曼光谱分析[12]，熟蛋壳膜的壳面和蛋面在<400 cm-1的范围内拉曼信号都减弱至消失(见图2)，说明半胱氨酸的构象发生了一定程度的改变。此外，在蛋白质和多肽的拉曼光谱中，S-S和C-C的伸缩振动带出现在500～700 cm-1[13]。其中C-C-S-S-C-C因峰值不同可能有三种构型，分别是扭曲-扭曲-扭曲式((510±5) cm-1)、扭曲-扭曲-反式((525±5) cm-1)和反式-扭曲-反式((540±5) cm-1)构象；C-S键有两种构象，分别是630～670 cm-1扭曲构象和700～745 cm-1反式构象[14-16]。如图2所示：熟蛋壳膜的壳面和蛋面在600～750 cm-1处有较明显的变化，说明熟蛋壳膜主要发生C-S构象的变化。此外，蛋壳膜还富含胶原蛋白，酰胺I的C=O伸缩振动在1 669 cm-1和1 637 cm-1，酰胺II的N-H弯曲振动和C-N伸缩振动在1 557 cm-1，酰胺III带的N-H弯曲振动谱线在1 267 cm-1和1 245 cm-1[13]，熟蛋壳膜在这些波数范围均无明显变化。由苯丙氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸的芳香基团引起的强拉曼光谱吸收主要体现于800～1 100 cm-1，苯丙氨酸的特征吸收频率为1 004 cm-1、1 033 cm-1，甲基和亚甲基的振动在1 451 cm-1、2 900～3 000 cm-1[10]。熟蛋壳膜在800～1 000 cm-1拉曼信号有较明显变化，我们推测芳香基团发生了氧化。熟蛋壳膜在1 400～1 500 cm-1、1 600～1 700 cm-1、2 800～3 000 cm-1均无明显变化。综上：熟蛋壳膜不管是蛋面还是壳面，其表面分子基团主要发生构象变化。芳香基团决定亲脂疏水性，熟蛋壳膜芳香基团拉曼信号的减弱也许也许更利于细胞黏附。

图2 蛋壳膜在785 nm光源下的拉曼光谱图

3 结 语

熟蛋壳在废弃蛋壳中占有相当的比例，为了有效利用这部分资源，使用扫描电镜和拉曼光谱仪初步观察分析熟蛋壳膜的回收可利用性。经过高温烹煮，熟蛋壳膜发生了热变性，其形貌和理化性能相应发生改变。轻微溶胀的纤维网状结构和部分表面分子基团的氧化并不制约熟蛋壳作为组织工程材料的适用性。我们推测熟蛋壳膜的热变性可能更利于其与细胞的互作，值得进一步分析研究。

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Microstructure Analysis of Cooked Eggshell Membrane and Its Raman Spectroscopy Detection

DILing

(Instrumental Analysis Center, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240, China)

Cooked eggshells occupy a considerable proportion of waste eggshells. After cooking, eggshell membranes thermal denaturize, physical and chemical properties change. In order to effectively use cooked eggshell membranes, we tested its microstructure and surface molecular groups. The microstructure and surface molecular groups of cooked eggshell membranes were detected, the recycling availability was preliminarily evaluated. By mimicking the cooking process cooked eggshell membranes were prepared. The microstructure was detected by SEM. The surface molecular groups were detected by Raman spectroscopy. It showed that cooked eggshell membranes remained fibrous mesh structure with slight swelling fibers, while the fibers did not collapse into pieces. The surface molecular groups decreased and it was mainly protein conformational change. We concluded that cooked eggshell membranes have recyclable availability.

cooked eggshell membrane; Raman micro-spectroscopy; microstructure

2014-08-01

狄 伶(1981-)，女，回族，宁夏固原人，博士，助理研究员，研究方向：医用生物材料。

Tel.:021-34206175-221；E-mail：di_l@sjtu.edu.cn

O 657.37

A

1006-7167(2015)05-0039-03