质量平衡法对氨基酸纯度定值的研究进展*

刘 照 戴新华 李孟婉 李红梅 暴海霞

(中国计量科学研究院，北京100029)



质量平衡法对氨基酸纯度定值的研究进展*

刘 照 戴新华 李孟婉 李红梅 暴海霞

(中国计量科学研究院，北京100029)

氨基酸纯度定值方法主要有质量平衡法、定量核磁法、滴定法和差示扫描量热法等。质量平衡法是指测量出氨基酸中的所有杂质，然后从100%中减去这些杂质(与主成分结构类似物杂质、水分、挥发性杂质、无机杂质)而得到其纯度值。质量平衡法适用于所有的有机纯物质定值，而且不确定度相对较小，目前物质量咨询委员会有机工作组把该方法作为有机纯物质纯度定值的基准方法。本文综述了采用质量平衡法对氨基酸纯品进行纯度定值时，对氨基酸中各类杂质检测技术的研究进展。

纯度定值；质量平衡法；氨基酸；杂质

0 引言

氨基酸是合成蛋白质的重要原料，对于促进生长，进行正常代谢、维持生命活动等具有重要意义。如果人体缺乏或减少其中某一种，人体的正常生命代谢就会发生障碍，甚至导致各种疾病的发生或生命活动终止。例如：甲硫氨酸帮助分解脂肪，能预防脂肪肝，心血管疾病和肾脏疾病的发生，防止肌肉软弱无力，将有害物质如铅等重金属除去，治疗风湿热和怀孕时的毒血症；色氨酸促进睡眠，减少对疼痛的敏感度，缓解偏头痛，缓和焦躁及紧张情绪[1-3]。由此可见，氨基酸在人体生命活动中非常需要。由于氨基酸的分析检测在各个领域[3](如食品、饲料添加剂、化妆品、临床医学、蛋白质组学等)都起着极其重要的作用，世界各国都高度重视对氨基酸分析方法的研究。而氨基酸纯物质中杂质定性和定量准确与否将直接影响其纯度值，从而进一步影响基体中该类物质的测量结果。因此，实现氨基酸中微量和痕量杂质的准确定性和定量是采用质量平衡法对氨基酸纯物质纯度测量的难题，也是制约我国氨基酸高质量纯度标准物质研发的主要技术瓶颈。针对质量平衡法将氨基酸中杂质分为与主成分结构类似杂质、易挥发性杂质VOCs、水分和难挥发性无机杂质四大类，分别对这四类杂质的测量技术展开讨论。

1 氨基酸纯度定值方法

纯物质是化学成分量分析的基础，其纯度值的准确性决定国家相关领域的测量水平[4-7]。如果纯物质的纯度或其中的杂质得不到准确定值，那么由此产生的国家最高级别的标准物质的特性量值就会出现偏差，从而对整个国家化学成分量测量的量值传递和测量结果产生极其严重的影响。目前分析有机纯品纯度的方法主要有直接法和间接法。氨基酸类纯度定值技术目前主要有质量平衡法、定量核磁法、滴定法和差示扫描量热法。

1.1 定量核磁法

定量核磁共振技术[8-10]作为一种日益成熟的分析方法，具有传统方法不可比拟的优势：样品预处理简单、测定快速准确、专属性强、不破坏样品等，现已在化学、食品、农业以及军事领域得到应用，目前常作为有机纯物质纯度定值的方法之一。

核磁共振法测定氨基酸纯度，只需要得到无干扰的定量峰，以及合适的、已知纯度的一种标准物质作为定量用内标，采用适当的氘代溶剂溶解样品和内标物．通过定量峰面积的测量，就可计算得到样品的纯度值。闫秀云等[9]利用1H NMR内标法对四种化合物进行了纯度分析，其结果与气相色谱法(GC)对比有较好的一致性。Szabolcs等[10]利用1H NMR、13C NMR将标准的肝素样品和受污染的肝素谱图进行对比，可以明显看到污染的肝素中存在杂质，通过扣除杂质干扰峰，可算出样品的纯度值。

1.2 滴定法

滴定法主要依赖滴定剂的官能团与主组分官能团进行显色反应。氨基酸中含有氨基和羧基官能团，能与茚三酮反应生成有色物质。刘飞飞等[11]利用茚三酮比色法测定了赖氨酸含量。该方法中，由于存在与主成分结构类似的杂质氨基酸，也将与茚三酮反应生成有色物质，因此测量结果会产生偏差[6]。

1.3 差示扫描量热法

差示扫描量热法(differential scanning calorimetry, DSC)是一种热分析技术，在一定的程序升温条件下，测量样品和参比物的功率差与温度的关系，适用于加热过程中不发生热分解、不与外界产生热效应的有机纯物质的纯度分析。Mathkar等[12]采用DSC法测定了多种有机纯度标准物质纯度。

1.4 质量平衡法

质量平衡法又叫杂质扣除法[6,12]，即从100%中减去与主成分结构类似杂质、水分、残留溶剂和不挥发性杂质。在各类杂质测定方面，质量平衡法克服了由于不同物质理化性质不同而造成的响应值的差异，无法准确测定杂质含量的缺点。利用不同物质的各方面性质的差异，实现氨基酸中主成分与杂质的分离，借助质谱、卡尔费休等分析技术对氨基酸中杂质含量进行定性定量。将各种分离和分析方法进行不同组合和联用，实现氨基酸中杂质含量的测定。

2 质量平衡法对氨基酸纯度定值中各类杂质的测量方法

2.1 与主成分结构类似有机杂质的分析技术

目前，氨基酸的生产方法主要是发酵法[13-16]，因此，氨基酸中的结构类似杂质也主要是一些含氨基和羧基的氨基酸类有机物[16]。为了对氨基酸结构类似物杂质进行定量，首先应采取合适的分离方法进行杂质与主成分的分离。关于20种氨基酸分离技术，报道的主要是色谱法及其联用技术[17-38]。利用色谱法分离氨基酸杂质，要求检测器对所有杂质都有响应信号。

2.1.1衍生法

在20种基本氨基酸中只有苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸有紫外吸收基团，氨基酸不易挥发，无法直接利用气相色谱分离，因此当采用HPLC-UV或气相色谱-氢火焰离子化检测器(FID)分析氨基酸结构类似物杂质时需要对样品进行衍生化，使氨基酸具有挥发性或紫外吸收。Fiechter等[18]以6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸脂(AQC)作为衍生剂，应用超高效液相色谱(UPLC-UV)能在23min内分离24种从发酵沉淀物中提取出来的游离氨基酸，与普通的液相色谱法相比缩短了分析时间，提高了分离度。还有文献报道用9-芴甲基氯甲酸酯(FMOCCl)[21，25]、乙氧亚甲基丙二酸二乙酯[26]等衍生试剂将氨基酸衍生，从而实现HPLC-UV同时分离检测多种氨基酸。

气相色谱法分析氨基酸具有柱效高、分析速度快、易与质谱仪联用等优点。由于氨基酸含有氨基、羧基和羟基等极性基团，易利用氨基酸衍生化试剂将其转变为易于汽化的衍生化产物，然后选择适当的色谱柱和检测器进行分离检测。Muhammad等[22]利用三氟乙酰丙酮和氯甲酸乙酯两步衍生法，成功分离19种氨基酸，但该方法衍生条件苛刻，不同氨基酸衍生反应速度不同或衍生化试剂也不同，不能采用同一根色谱柱实现全部氨基酸的测定，样品要经脱盐处理，实验过程繁琐且易带来污染。

随着气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)的快速发展，一些学者将其应用于氨基酸的分析检测，气质联用相对于简单的气相色谱法可以明显提高对样品的检测限和灵敏度。Magdalena等[23]利用氯甲酸丙酯进行衍生后采用GC-MS进行检测，检出限在3.2～446nmol/L之间。Chen等[24]通过同样的试剂衍生，得到比较一致的检出限(50～250nmol/L)。由于衍生化过程复杂、费时，而且会引入一些副产物，因此，对于氨基酸纯度定值来说，可能将导致定值结果的偏差。

2.1.2 直接法

氨基酸大部分没有紫外吸收，所以直接检测氨基酸目前一般采用ELSD[27-29]、CAD[30]、MS[31-38]等检测器。20种基本氨基酸中只有亮氨酸和异亮氨酸的分子量相同，目前，氨基酸反相液相色谱法[31-32]均能分开亮氨酸与异亮氨酸。由于质谱法的特异性，利用HPLC-MS法可以分析在色谱上分离度不好的氨基酸。HPLC-MS法具有较高的灵敏度和选择性，能够提供足够的样品结构信息，抗干扰性能好，无须对样品进行衍生处理，定性定量能力强，有很好的发展趋势。

Dan等[29]利用HPLC-ESLD在25分钟内检测了14种氨基酸，检测限在20～56mg/L之间。Roberta等[31]利用HPLC/ESI-MSMS非衍生化对艺术壁画中21种氨基酸含量进行了准确的定量，检测限在0.09～56.2μg/g之间。Jia等[16]利用丹酰氯衍生化，用LC-TOF-MS可以同时检测发酵食物样品中23种氨基酸和7种生命必须氨基酸。尤其是串联质谱具有特征离子提取功能，在检测时对于氨基酸的分离度要求相对较低，对于氨基酸中结构类似物杂质定性是一种强有力的分析手段。近年来同位素标记法[37-38]应用于氨基酸分析发展快速，使得氨基酸定量越来越准确。

在氨基酸纯品定值中结构类似物杂质是最主要的一类杂质，且大部分为氨基酸类物质[16，45]。由于每种方法都有其局限性，所以对于氨基酸结构类似物杂质的分析，需要多种分析手段进行相互确认和验证。Megumi等[45]比较了邻苯二甲醛衍生法(OPA)、AQC衍生法、离子对反相色谱质谱联用法(RP-LCMS)分析异亮氨酸、缬氨酸等氨基酸，通过OPA法优越的分离手段，采用RP-LCMS对氨基酸杂质进行定性。

2.2 挥发性杂质的分析方法

在有机纯物质纯度测量中，通常存在微量残留溶剂[56]称为挥发性杂质(VOCs)。目前，VOCs的检测方法[46-48]有气相色谱法和气相色谱-质谱联用、离子迁移谱和质子转移反应质谱法。气相色谱法作为VOCs的常用分析方法，可以对微量和痕量组分进行定性和定量。检测过程分为：采集气体样品、进行预处理、富集、气相层析分离，再采用适宜的检测器(FID、MS等)进行检测。周宏[46]建立了吹扫捕集-气相色谱/质谱联用测定饮用水中59种挥发性有机物的方法，检出限为0.004～0.085μg/L，可满足饮用水中特定有机分析项目的检测要求。Joost等[47]提出了质子转移质谱法，能够在线、快速、实时地检测气体样品中的残留溶剂。许秀艳[48]等总结了顶空进样法与GC-FID和GC-MS联用，比较适用于有机纯物质中残留溶剂的定性和定量，能快速、准确地检测常见的残留的挥发性溶剂。

2.3 水分分析方法

对于纯度标准物质，水分含量的测量是非常重要的。目前应用广泛的水分含量测定的方法[49-53]主要有热重和卡尔费休法。热重分析法要求加热过程中样品不分解。另外，有些结晶水不一定能完全逸出，样品中残留的挥发性溶剂，也可能在加热过程中逸出，影响水分含量的测定。Yazgan等[49]采用热重-质谱联用仪检测了热失重过程中逸出的水分、降解产物和易挥发性物质。

卡尔费休法包括库仑法和容量法，是国际公认的测量纯度标准物质中水分含量的常用方法，可以测量固体和液体有机物和无机物中的水分[50]。周剑[51]等考察了环境湿度、开盖加样时间、基线漂移和空白值对测量结果的影响。结果表明，在环境相对湿度低于35%，加样时间控制在8s以内时，基线漂移比较稳定，空白值比较低且稳定。王海峰等[52-53]采用库仑法、容量法和定量核磁共振法测定了一系列水分标准物质。库仑法与容量法之间的偏差为0.06%，核磁法与库仑法之间的偏差为0.50%，不同方法之间测定结果的一致性较好。

对难溶于卡尔费休试剂的氨基酸纯度样品，Kestens等[50]研究了加热汽化库仑滴定法。该方法考察了样品质量、载气种类、流速、炉温对测量结果的影响，与此同时对标准水样进行了测量验证。结果表明，最小样品量大约2mg，惰性气体种类对测量结果影响不明显，气体流速50mL/min，炉温140℃是最优条件，与直接加样的库仑法相比，加热汽化进样法有较好的重现性和更小的不确定度。

2.4 不挥发性杂质的分析方法

有机纯物质中无机杂质含量的测定[54-57]目前国际上主要有电感耦合等离子体质谱、热重分析和灼烧残留等。

电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法是一种新的微量(10-6)、痕量(10-9)和超痕量(10-12)元素分析方法。可测定元素周期表中大部分元素，低检出限、宽的动态线性范围、谱线简单、干扰少、分析速度快、可提供同位素分析[54]。Zhang等[55]通过微波消解能同时检测草莓和蓝莓中18种基本元素，线性范围为0～1250.0μg/L。戴等[56]在国际比对CCQM-K55C中采用ICP-MS测L-缬氨酸中不挥发性杂质，同时用热重分析和灼烧残留作为验证，结果相一致。

3 展望

为了研制高水平的氨基酸纯度标准物质，需要先建立高准确度的氨基酸定值方法，保障定值结果的可靠性和溯源性。本文介绍了质量平衡法以及氨基酸纯物质中四类杂质的分析方法原理、应用实例和局限性。与其他有机纯物质类似，氨基酸纯度标准物质中杂质主要分为与主成分结构类似物杂质、挥发性有机物、难挥发无机杂质、水分四类。因此，通过对这四类杂质检测方法的研究，建立较为完整的氨基酸纯度定值技术体系，为氨基酸纯度标准物质的研制提供技术支撑，将对生物、临床医学、食品监测和化学化工等许多领域中氨基酸成分量的准确测量提供高准确度的纯品标准物质。

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*课题项目：国家科技支撑计划(2013BAK10B01)

10.3969/j.issn.1000-0771.2015.08.02