胃癌的液相活检

摘要：本文通过系统回顾外周血循环肿瘤细胞、循环细胞外核酸在胃癌早期诊断、预后评估、治疗监测中的作用，阐述其作为新型生物标记物的可能性，介绍胃癌液相活检的概念由来和其潜在的临床应用价值。

收稿日期：2015-05-11

基金项目：国家高技术研究发展计划（863计划）（2012AA021103）

作者简介：王达，八年制博士，E-mail: wangda.0618@aliyun.com

通信作者：李国新，博士，主任，教授，博士生导师，电话：020-61641682，E-mail: gzliguoxin@163.com

Liquid biopsy of gastric cancer

WANG Da, LI Tingting, LEI Shangtong, LIU Hao, LI Guoxin

Department of General Surgery, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China

Abstract: The literature concerning the role of circulating tumor cells and cell- free nucleic acids in gastric cancer were systematically reviewed with respect to early diagnosis, prognosis evaluation and therapy monitoring. Both of them considered as candicates were explored to be potential biomarkers. Herein, we introduced the origin of the novel concept, liquid biopsy of gastric cancer, and possibility of their clinical application in therapeutic management of cancer patients.

Key words: gastric cancer; liquid biopsy; circulating tumor cells; cell-free nucleic acids

胃癌是世界上是第4大最常见的癌症，占癌症相关死亡第2位 ［1］。尽管近些年来诊断技术和围手术期管理等方面得到很大改进，但胃癌的控制形势依然不容乐观，在胃癌死亡率没有明显下降的情况下，每年全球新发胃癌病例近90万例 ［1］。这主要与以下几个方面因素相关，一是缺乏行之有效进行早期诊断的方法；二是缺乏科学系统的预后评价指标；三是进展期胃癌手术或化疗治疗充分性存在不足；四是胃癌的发生发展机制及其产生耐药的原理尚不清楚。因此，为了改善胃癌患者的临床结局，早期发现和准确监测疾病发生进展是十分必要的。

许多遗传和表观遗传学的改变促进了肿瘤的发生、进展，越来越多的研究发现这些变化能够用于诊断胃癌在内的恶性肿瘤，并能评估其预后，或者作为制定治疗方案的依据 [2,3]。通常，对于实体肿瘤来说，只有手术活检标本才可用于检测肿瘤相关的分子水平上的改变，但传统的组织活检病理有诸多限制：（1）单处取材无法体现异质性；（2）单次活检无法实现动态监测；（3）活检本身创伤大并容易致播散。所以，如能开发一种非侵入式的检测方法在血液中获取生物标记物，能够实时监测肿瘤的发生发展并能反馈药物治疗反应意义重大，可以有效克服上述传统方法的缺点。基于此想法，“液相活检”这个概念应运而生，而循环肿瘤细胞（CTC）和细胞外游离核酸（cfNA）的发现使之从理想变为现实创造了条件 ［2，4］。本文就CTC、cfNA与胃癌的最新研究进展作一综述。

1　循环肿瘤细胞与胃癌

1.1循环肿瘤细胞的发现与检测

自Ashworth在1869年第1次发现CTC以来，对CTC的关注从未间断，研究者们在不同实体肿瘤患者的血液中验证CTC的存在 [5]。早期，由于技术瓶颈，从外周血中精确检测极低浓度的CTC是一个巨大挑战。近些年来，随着技术发展，CTC的分离富集问题迎刃而解，目前主流方法有物理法和免疫学两种。前者主要根据CTC大小、密度、电荷、迁移变形能力等进行分筛 [6-7]；后者则通过CTC表面携带的特定结合位点进行抗原抗体反应来进行获取 ［8-9］，所获得的CTC可以通过（荧光定量）PCR、FISH、标记抗原识别等技术手段进行鉴定。目前这两种方法都能在集成系统中实现，为后续的CTC相关研究创造可能 ［10-11］。

1.2循环肿瘤细胞在胃癌研究中的作用1.2.1利用循环肿瘤细胞寻找胃癌易感基因获得CTC后，RT-PCR一度成为主要研究手段，用以发现易感基因及其生物学功能。至今为止，与胃癌涉及紧密的主要有人端粒酶反转录酶（hTERT),细胞角蛋白(CK)家族, CEA和黏蛋白1（MUC1）等 ［12-14］。但其固有的高假阳性率限制了该领域的进一步发展，直到引入定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）后有了起色。但Wu等人 ［14］并不满足于此，他们发明了一种高通量比色膜阵列，能够同时检测四种标记物，可较为敏感地预测胃癌患者的总生存率和术后复发转移率。最近，非编码RNA比如microRNA（miRNA）和Piwi-interacting RNAs（piRNA）等被证实在肿瘤发生进展中表达异常，这一特异性改变有望成为胃癌CTC检测的突破 ［15-16］。然而，这种从外周血单个核细胞获取的总RNA却不能排除源于白细胞的RNA的干扰而纯粹真实地反应CTC中miRNA。当然，这也同样困扰着外周血细胞外游离miRNA的检测。如何减少杂质RNA的影响，可能要从寻找更为敏感确切的特异性miRNAs和piRNA入手，只有这样才能更符合转化医学的需要。

1.2.2利用循环肿瘤细胞监测胃癌　肿瘤的复发、转移与不良临床预后关系紧密，并严重影响胃癌患者的生活质量。近来，不断有研究提示CTC本身即可作为临床预后指标。Hiraiwa等 ［17］利用CellSearch System发现外周血中CTC≥2组总生存率显著低于CTC<2组；Matsusaka等 ［18］人则发现CTC≥4组的化疗病人总生存期和无进展生存期要显著小于CTC<4组，这一发现启示我们，CTC水平也许与化疗药物治疗反应相关。还有研究者将围手术期的胃癌病人外周血CTC水平进行了动态监测，结果发现术后CTC水平较术前明显降低，有趣的是，部分研究提示术中CTC水平会有所增加，尽管这一现象尚有争议，但至少说明一点，CTC可能作为监测肿瘤动态变化的生物标记物 ［19］。

CTC所携带的基因、蛋白亦被认为潜在的预测指标。不少研究提示CEA、CK系列等标记物的mRNA水平与胃癌的总生存期、无进展生存期等相关 ［12, 20-21］。其中，值得注意的是，Mimori等 ［22］利用基因芯片技术筛选得到膜基质金属蛋白酶1（MT1-MMP）基因，通过qRTPCR检测MT1-MMP mRNA水平发现其为胃癌复发、转移的独立危险因素，这是目前临床样本量最大的研究之一。

目前CTC在胃癌领域的相关研究已有弥足进步，是具备巨大开发前景的潜在胃癌标记物。但是，我们对于外周血中这一类细胞的生物学特性尚知之甚少，是下一步研究攻克的方向，以便更好地理解其在胃癌进展和耐药发生过程中的生物学行为。

2　细胞外游离核酸与胃癌

2.1细胞外游离核酸的发现与检测

细胞外游离核酸(cfNAs)包括DNA、RNA、microRNA等组成。细胞外游离核酸最早由Mandel和Metais 于1948年在血浆中发现，却直到1977年由Leon等 [4]人报道在肿瘤患者血清中发现细胞外游离脱氧核酸（cfDNA）才受到重视。1989年Vasioukhin等 ［23］首次证实肿瘤组织能够释放DNA至外周血中，这一假设被后续的NRAS和KRAS基因研究所佐证 ［24］。随后RNA、miRNA相继在外周血中被发现。关于细胞外游离核酸的来源目前有被动和主动释放两种主要学说，前者认为，细胞外游离核酸主要来源于凋亡或坏死的细胞；后者可能的解释为，肿瘤细胞通过释放DNA入血，由远处的特定的靶细胞负责接收，这也许是肿瘤转移可能的发生机制，目前尚缺乏足够证据支持 ［25-27］。还有人推测细胞外游离核酸来源于CTC，但两者数量级别并不对等，因而争议颇多 ［2, 28］。因为细胞外游离核酸在血浆或血清中存在，故检出手段并无特殊。

2.2细胞外游离核酸在胃癌研究中的作用

2.2.1利用细胞外游离DNA监测胃癌细胞外游离DNA在肿瘤领域的研究由来已久，主要涉及到肿瘤相关的基因或表观遗传学的改变，包括微卫星不稳定性、杂合度消失、基因多态性、定点突变、基因甲基化、染色体缺失转位和基因片段缩短等方面。目前研究较为成熟的经典案例，如外周血中的细胞外游离DNA中的KRAS基因突变与结直肠癌抗EGFR单抗药物获得性耐药之间的联系紧密 ［29］，在此基础上，Misale等 ［30］发现能在西妥昔单抗治疗的肿瘤病人中检出血液KRAS基因等位基因突变，而根据这一结果能早于影像学检查约10个月得出耐药结论。此发现提示我们外周血细胞外游离DNA是潜在的肿瘤特异性标记物，可为肿瘤综合治疗个体化方案提供依据。

利用细胞外游离DNA检测胃癌的研究亦有较大进展，其中除了将细胞外游离DNA总量、外周血管家基因、非编码基因组DNA水平改变做为检测指标外，值得注意的是，DNA甲基化研究领域突破最大。自Lee等 ［31］在2002年首次报道死亡相关蛋白激酶,钙黏蛋白E-cadherin，谷胱甘肽转硫酶pi基因1（GSTP1），p15 and p16 DNA甲基化水平能够有效预测胃癌以来，甲基化CpG岛微阵列技术等新手段的出现为寻找更为可靠的目标基因奠定了基础。目前，XAF1基因DNA甲基化最受瞩目，Ling等 ［32］证实其为胃癌预后的较好指标，敏感度和特异度分别为69.8%和100%。而在传统的肿瘤特异性基因检测领域，外周血MYC被Park团队 ［33］证实与胃癌标本中的相同基因的变化趋势一致，而在HER-2 ++ 或+++的胃癌病人中外周血HER-2水平与组织标本中变化趋势不一致 ［34］。争议伴随着进步，这方面研究尚属起步阶段，未来将有新的证据来阐释这些矛盾。

2.2.2利用细胞外游离RNA监测胃癌起初，RNA因容易降解而不可避免地会丢失一些信息，故其在外周血检测时是否能够准确反映肿瘤发展遭受质疑。科学家们一度曾把目光转向外周血RNA酶的检测，但并未有很大突破。1999年，人们开始发现外周血中相对稳定存在的RNA，一部分以蛋白脂质形式存在，另一部分则以小分子RNA形式存在 ［35-36］。科学家们首先在鼻咽癌患者血液中发现一种EB病毒相关的RNA，能够特异性地反应肿瘤相关临床特征 ［36］。随后，MUC1、CXCR4等基因的mRNA相继被报道与胃癌进展相关 ［37］。之后，Kang等 ［38］证实外周血hTERT mRNA的变化可作为胃癌诊断预后检测的潜在标记物。

目前，这些RNA稳定存在的机制尚不明确，当下广为接受的主流假说是囊泡分泌学说 ［39］。即便产生的方式尚完全不为人所知，外周血细胞外游离RNA已成为肿瘤领域的研究热点，而其中的miRNA更是炙手可热的话题。

2.2.3利用细胞外游离miRNA监测胃癌miRNA是一种由小片段核酸组成非编码RNA，能通过抑制mRNA稳定性和翻译过程实现基因转录后调控。大量研究证实miRNA在细胞增殖、分化、凋亡、上皮间质化（EMT）、肿瘤转移等领域发挥重要作用。自2008年以来，聚焦于外周血miRNA与恶性肿瘤之间关系的研究呈现井喷式爆发，相关的技术手段亦随之得到长足进步，目前已开始向高通量集成方向发展。2010年，Tsujiura等 ［40］首次报道外周血miRNA (miR-17-5p, miR-21, miR-106a, miR-106b and let-7a)可能成为胃癌新的肿瘤标记物。此后，近30种miRNA先后被发现在胃癌的不同阶段表达异常，均提示着其作为新生物标记物的可能性。然而，至今为止miRNA作为检验指标尚有几个问题亟待解决：（1）如何消除个体差异；（2）如何筛选待检的miRNA；（3）如何界定临界值？这些问题部分来源于人体内复查的miRNA调控网络，因为1个miRNA可调控多个mRNA，而特定mRNA又可由多个miRNA调控。为了克服这一缺陷，人们开发了miRNA基因组分析方法，并由此得到目前最有开发前景的两个生物标记物miR-451和miR-486，各自在受试者工作特征曲线中的曲线下面积为0.96和0.92，提示胃癌预测准确性较高 ［41］。尽管如此，它们的有效性还需要大规模的临床研究来验证。

2.2.4利用细胞外游离lncRNA监测胃癌长链非编码RNA (lncRNA)由200个以上核酸序列组成，因为不含开放阅读框而无法编码蛋白，但却能广泛参与RNA加工过程，进而调控基因、影响染色体的修饰。lncRNA日益成为当下的研究新宠，在发育学和肿瘤学方面饱受关注。最近，Arita等 ［42］首次报道利用细胞外游离lncRNA监测胃癌，研究发现胃癌患者外周血中lncRNA H19较正常人显著升高，而在术后下降，提示H19是良好的诊断指标。虽然我们对lncRNA还知之甚少，随着研究深入，相信会有更为喜人的突破。

3　结论

综上所述，得益于技术手段的突飞猛进，使得利用外周血进行胃癌的“液相活检”成为可能。无论是循环肿瘤细胞还是循环细胞外游离核酸，在胃癌领域的研究都尚处摇篮时期，但其潜在的实用价值已初见端倪。未来，将有大规模的临床研究筛选得到切实有效的生物标记物，能够用于胃癌的预测、诊断、评估和监测，从实验室到临床的成功转化最终使广大胃癌患者受益。