SELEX 技术的研究进展及在医学中的应用

朴喜航，任姝颖，夏 薇 (北华大学医学检验学院，吉林 吉林 132013)

指数富集配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)是一种能获取与靶分子高选择、高亲和力结合的寡核苷酸的筛选技术，制备出的产物被称为适配体(aptamers)［1］。适配体安全、无毒，具备特殊的三维结构，确保了其可与靶分子高特异性的结合，并可进一步改变靶分子的生物活性和生命进程。适配体最大优势是没有免疫原性，并且分子量小、可化学合成、稳定性强、易于修饰和标记，与传统化学方法和免疫学方法相比，具有无可比拟的优越性。近年来在传统SELEX 技术基础上，各类衍生SELEX 技术也被不断发展和完善，被广泛应用在生命科学研究、生物医药等领域，特别是在疾病的诊断与治疗等方面，显示出广阔的应用前景。目前已有几种适配体诊断技术和适配体药物进入到了临床试验或临床应用阶段［2］。

1 SELEX 技术简介

1.1 筛选过程

SELEX 技术依据分子生物学的原理，首先人工构建一个随机寡核苷酸文库，随机核苷酸序列的长度为20 ～40 bp 左右，库容量为1014～1015个寡核苷酸，所包含的不同种立体构象，几乎可以涵盖自然界存在的所有种类的靶分子［3］。将靶标物质与随机文库在一定条件下进行混合，形成文库-靶标复合物，把未结合的核酸洗脱掉，富集与靶物质结合的核酸分子，以后者为模板进行PCR 扩增，得到的产物经分离纯化后，作为进行下一轮筛选的模板。如此反复，通过多轮(8 ～15 轮)筛选，与靶标不结合或亲和性弱的核酸分子被充分去除，而与靶分子亲和性强的核酸分子被分离出来［4］，同时其纯度随着筛选轮数的增加而增加。最后筛选到的文库要经过克隆测序和特异性修饰，经过这些步骤后，所获得的特异识别靶分子的核酸才是适配体［5］。

1.2 优势和特点

1)亲和力高、特异性强。适配体与靶标之间，凭借彼此互补的三维结构，相互作用后形成牢固稳定的复合物，其解离常数通常能达到pmol/L ～nmol/L 的水平，并且能分辨出靶标结构上细微的差别。

2)库容量大，识别范围广泛。SELEX 技术的靶标远远多于经典的抗原抗体结合反应，除了有蛋白质、核苷酸分子外，还可以是糖类、氨基酸、维生素、抗生素、金属离子、有机染料，甚至可以是细菌、病毒、寄生虫等完整的细胞或组织，几乎囊括了自然界中的全部物质［6］。

3)合成容易，获得方便，易于修饰。适配体的体积比传统抗体小，筛选过程简便、周期短，对实验室的要求不高，并具备自动化控制的巨大潜力。经过化学合成和修饰以后可保持原生物活性不变，还可以增强其稳定性并增加其他新的化学性质，参加多类反应。标记了荧光、生物素和纳米金颗粒之后，发展出了诸如分子成像技术等疾病诊断新方法。

4)重复性好，纯度高。整个筛选和制备的过程在人为控制之下，所得到的适配体几乎没有生产批次之间的差异，便于日后的大规模生产和应用。

5)分子量小、稳定性高。相对于抗体或酶，适配体的化学性质更稳定，不易降解，对温度不敏感，保存时间长，即使变形也能在很短的时间内复性，利于室温下运输［7］。

6)应用便捷。SELEX 技术所获得的适配体又被称作是核酸型抗体，其优于传统抗体的性质是没有免疫原性，因此便能获得一些低免疫原性甚至无免疫原性靶分子的适配体。并且还省去了传统抗体制备过程中的动物实验，而直接从体外文库中获取［8］。而且适配体更容易通过细胞膜，并且没有毒性，利于检测细胞内的靶分子和实现多层次的调控，并能较快地被机体清除代谢掉，经过特定的化学修饰后，还可使半衰期延长，稳定性提高，便于科学研究和疾病诊治。

2 SELEX 技术的发展

目前SELEX 技术出现了一些新的筛选方法，越来越多的与各种标靶相对应的适配体被筛选出来。如毛细管电泳法、硝酸纤维素膜过滤法、磁珠分离法、亲和色谱法、Non-SELEX 技术、无引物PCR-SELEX技术、微流体SELEX 技术、生物芯片SELEX 技术、原子力显微镜等各种新的模式也被应用到适配体的筛选中。同时还出现了SELEX 技术与定量PCR，SELEX 技术与流式细胞仪、SELEX 技术与ELISA 的联合应用，更是极大的提升了筛选的效率和准确性。

2.1 消减SELEX 技术

消减SELEX 技术是一种经过改良的SELEX 技术［9］。以完整细胞为靶标的消减SELEX 技术，是在筛选过程中以完整的细胞作为靶标，并消减掉能与已知或未知的共有靶标结合的配体，经过消减后的次级随机文库再投入到特异靶标的筛选中。它的意义在于可以实现从两组高度同源的完整细胞中，筛选出针对其中一种细胞的特异性适配体。这项技术可应用于发现新的肿瘤细胞识别结构［10］，还可进一步作为“生物导弹”，独立完成靶向治疗或携带药物，未来将会在肿瘤的治疗中发挥巨大的功效。

2.2 自动化SELEX 技术

传统的SELEX 技术过程需要完成一套重复繁琐的操作，使得筛选相对耗时耗力。自动化SELEX 技术的建立可以简化筛选过程，节约时间和物品的消耗，实现高通量和限定范围，达到同时筛选多个靶分子的效果［11］。自动化SELEX 技术离不开现代分离仪器的配合，后者的发展推动了前者的进步。2001年Cox 等使用Biomek 2000 自动化工作站成功筛选到了溶菌酶的特异性适配体，通过这种自动化筛选平台，不到2 d 就完成了12 轮的筛选［12］。

2.3 导向SELEX 技术

适配体的特异性是整个SELEX 技术的核心所在，为了提高适配体的特异性和稳定性，可将已知的能与靶标非特异结合的分子掺入到文库中或预先与靶标进行混合后再筛选，这样可获得只与靶标特异结合的适配体。2002 年Hamm 等将此技术与抗个体基因型的方法联合运用，成功获得了特定激酶抑制剂的特异性RNA 适配体［13］。Martell 运用特殊的导向SELEX 技术，从随机表达盒杂交文库中筛选到了能与E2F 蛋白具有高亲和性的RNA 适配体［14］。

3 SELEX 技术在医学中的应用

3.1 SELEX 技术在基础医学研究中的应用

依据核酸适配体具有与靶物质高特异性结合的能力，可以帮助我们寻找到疾病的发病机制。Roulet等提出把SELEX 技术同基因表达串行分析手段联合应用，并通过自动化的序列提取工艺，建立转录因子结合位点的定位模型。通过对转录因子适配体文库中的某一序列进行测序，可了解该蛋白结合位点的特异性，探寻一些以前在基因组中从未研究过的结合位点，掌握在不同的核苷酸位点上非独立碱基出现的先后顺序，为阐明其结合机制提供一些线索［15］。Bianchi 等采取SELEX 技术发现，TRF1 二聚体在端粒上有两个相同的识别半位点，它们的距离可以变化，且两个半位点的顺序方向没有区别。这为探索端粒长度的调节机制提供了新依据［16］。

3.2 SELEX 技术在疾病诊断中的应用

肿瘤细胞及其标志物的早期检测对于肿瘤的诊断及预后极为重要，目前已经筛选出多种肿瘤的特异性适配体，例如急性髓系白血病的适配体KH1C12、急性淋巴细胞白血病的适配体sgc8/sgc3/sgd3、恶性胶质瘤的适配体GBI-10、Burrkitt 淋巴瘤的适配体TD05、非小细胞肺癌的适配体S1/S11e/S15、小细胞肺癌的适配体HCA12/HCC03/HCH07/HCH01、乳腺癌的适配体KMF2-1a、结肠癌的适配体KDED2/KDED7/KDED9/KC2D3、小鼠肝癌的适配体TLS9a/TLS11a、卵巢癌的适配体DOV3/DOV4/DOV6。它们可以特异地识别肿瘤细胞，仅需少量肿瘤细胞即可实现准确的鉴别和分型。将适配体与纳米颗粒结合后通过比色检测，观察颜色的变化即可判断有无靶标细胞。这个实验非常敏感，样本中的靶细胞数超过百个即可检测出来［17］，还不需要昂贵的检测设备和待检靶标的标记与修饰。因此，有可能成为常规筛查活体标本中新生肿瘤细胞的一种新方案。与此同时肿瘤细胞的分子成像技术也已经问世，它能够从细胞水平对生物过程进行可视化描述及测量，不仅能定位病灶，观察某些影响肿瘤细胞行为的生物过程，还能观察肿瘤细胞对药物的反应［18］。Kim 等研究将前列腺特异性膜抗原(PSMA)的特异性适配体与金纳米材料结合后，带有PSMA 的前列腺癌细胞便能够被特异性地标记出来，将其作为造影剂应用在前列腺肿瘤的影像学诊断中，比传统的造影剂显像时间更持久，毒副作用更小，应用价值更显著［19］。

SELEX 技术还在血液的生化检查方面，显示出一定的应用前景。用其检测血液中的某些靶分子，将比传统方法更特异和高效。脑尿钠肽(BNP)常被临床上用来评价急性心力衰竭或急性呼吸窘迫症患者的病情和预后。Lin 等采用SELEX 技术的原理，筛选到了能与BNP 特异结合的适配体。在微流体试验模式下，被荧光标记的适配体可以快速测出血液中BNP 的浓度，比放射免疫分析法或是免疫分析技术更精确、更经济［20］。C 反应蛋白(CRP)是机体在应激状态下生成的一种非特异性的急性时相反应蛋白，CRP 与冠状动脉粥样硬化、心肌梗死等心血管疾病具相关性［21］。Bini 等开发出了一种带有光化学性质的CRP 特异性适配体，当血液中的CRP 浓度超0.005 mg/L 时就能被检测出来，敏感度非常高。这一成果为新型CRP 诊断试剂的研制奠定了基础［22］。

SELEX 技术还被应用在病原微生物的检测，其能克服传统检测方法在特异性和敏感性上的缺陷，为新型检测试剂盒的开发提供有力支持。例如结合分支杆菌的特异性适配体CSRI 2.11 检测过程比传统的培养鉴定法更省时更敏感;丙型肝炎病毒的适配体ZE2 可结合酶联免疫吸附试验实现丙型肝炎的早期筛查，不受抗体检测时窗口期的制约;疟原虫乳酸脱氢酶的适配体PL1 在临床实践中，可以很好的区分患者是否感染了出间日疟原虫或恶性疟原虫［23］。

3.3 SELEX 技术在疾病治疗中的应用

SELEX 技术在疾病治疗中的功效越来越来受到人们的重视。适配体在体内与靶分子结合，理论上可以对靶分子的生理功能和代谢过程产生影响，靶分子也会因此发生信号传导的改变甚至丧失原本的功能，直接或间接阻断疾病发生进程［24］。以此开发的靶蛋白功能阻断剂，日益显示出其巨大的潜力。全球首个适配体药物是2004 年由美国食品和药物管理局批准上市的哌加他尼钠，可用来治疗老年性黄斑变性。

SELEX 技术在凝血系统疾病的治疗上具有一定的意义，已找到了可用作抗凝血和抗血栓药物的适配体REG-1，其结合的位点是凝血酶的肝素结合位点以及纤维蛋白原结合位点［25］。在治疗免疫系统疾病方面，也已获得了具有药物开发潜力的特异性适配体［26］，如可用来拮抗自身抗体已达到治疗系统性红斑狼疮的适配体，还有能刺激T 细胞释放的4-1BB 的适配体。对于肿瘤的治疗，基于SELEX 技术研制的适配体药物更是走在前列，进入到了临床试验阶段。如对实体瘤和复发性急性髓样白血病有良好疗效的AS1411，更出现了连接金纳米棒的适配体，用作肿瘤靶向光热治疗［27］。适配体药物作为抗病毒药，也展现出良好的前景，比如用来抑制狂犬病病毒的复制和干扰艾滋病病毒的体内合成［28］。除此以外，核酸适配体还可作为运输工具，特异性地把药物运送至靶标细胞或组织达到定点清除的治疗效果，研究比较成熟的有装载着阿霉素，用来杀伤前列腺癌细胞的复合适配体药物［29］。

4 展 望

目前，越来越多可用于疾病诊断和治疗的适配体被逐步筛选出来，并被广泛地应用在生物医学的各个领域。然而其在临床中的大规模应用仍为时尚早。还有许多问题亟须解决，例如具备高特异性、高亲和力的适配体数目还相对较少;实验室环境中筛选出的适配体，在体内复杂环境下发挥作用的实际效果尚不完全掌握;筛选过程还需进一步简化，产物的特异性和稳定性还应进一步提高，以及对适配体的修饰和优化方案还需进一步明确。相信随着现代技术的进步，上述各种问题终将攻克，SELEX 技术在生命科学和生物医药领域中的应用前景将会更加广阔。

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