CELL-DYN Sapphire血液分析仪的CD61免疫学法、光学法、电阻抗法在低值血小板计数中的比较与应用

张驰，张洪波

(华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科，湖北武汉430030)

CELL-DYN Sapphire血液分析仪的CD61免疫学法、光学法、电阻抗法在低值血小板计数中的比较与应用

张驰，张洪波

(华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科，湖北武汉430030)

目的评价和比较CELL－DYN Sapphire血液分析仪的3种检测方法在低值血小板(PLT)检测方面的优劣性。方法选择基础血液病或肿瘤化疗后引起的PLT低于50×109/L 100例，分别使用电阻抗法、光学法和CD61免疫学法3种方法进行PLT计数，并与显微镜手工法(MPLT)作比较。运用SPSS 19.0和MedCalc V12.7.2.0分析软件对数据进行方差分析、Passing－Bablok回归分析和Bland－Altman偏倚分析。结果ANOVA分析显示，电阻抗法、光学法PLT计数与MPLT比较，差异有统计学意义(分别为P=0.00，P=0.002)，CD61免疫学法与MPLT差异无统计学意义(P=0.915);OPLT和CD61免疫学法与MPLT的相关性较好(分别为slope 1.0，95%CI为0.95～1.06，r=0.946和slope 1.0，95%CI为0.99～1.01，r=0.998)，电阻抗法与MPLT的相关性较差(slope 1.27，95%CI为1.10～1.44，r=0.845)。通过偏差分析，电阻抗法、光学法PLT计数比MPLT检测的数值更高(差异均值分别为6.3、1.3)，CD61免疫学法与MPLT检测的数值差异无统计学意义(差异均值=－0.02)。结论在低值PLT的检测中，电阻抗法与MPLT存在明显的统计学差异，相关性差，且结果有明显偏差(偏高);光学法与MPLT存在统计学差异，结果仍存在少量偏差(偏高)，但相关性较好;而CD61免疫学法与MPLT均值无明显差异，相关性好，结果无明显偏差。所以，当临床出现低值病例时，推荐使用CD61免疫学法PLT进行计数。

低值PLT;CD61免疫学法;光学法;电阻抗法;CD－SAPPHIRE;预防性血小板输注

如何准确地计数外周血循环中的血小板(PLT)，一直以来都是医学界的热门话题。但实际工作中，尤其是在低值PLT计数时，想得到一个准确的结果，却绝非易事。当今市面上的血液分析仪大多数采用电阻抗法，即库尔特原理。因为其本身特性的限制，易受细胞碎片、小红细胞、大PLT、PLT聚集簇、细菌等非PLT颗粒的影响，这种缺陷对低值PLT样本进行计数时，影响尤为显著。而雅培公司的CD－SAPPHIRE血液分析仪在保留电阻抗法的同时，增加从两维度分析细胞的多角度散射光法，使小红细胞、红细胞碎片与PLT更容易分辨，提高了PLT测定的准确度和精密度。但因光学法每次计数PLT的绝对数量低于电阻抗法，其重复性仍劣于电阻抗法。此外，该设备还具有免疫学原理和流式细胞术相结合的技术检测PLT，即利用CD61单克隆抗体特异性结合PLT表面糖蛋白Ⅲa的特性，先用含有荧光基团(如异硫氰酸荧光素)的单克隆抗体(CD41或CD61)标记PLT，排除血液中“非PLT颗粒”的干扰，再行计数，使其准确性有所提高[2]，对检测低值PLT标本和存在干扰的病理性血液标本具有重要意义[3]。我们将系统性地探讨CDSAPPHIRE血液分析仪CD61免疫学法与其它两种分析方法(电阻抗法和光学法)比较的优劣性和临床应用价值。

材料和方法

一、一般材料

2012年6月至12月，在华中科技大学同济医学院附属同济医院收集全血标本光学法(OPLT)计数≤50×109/L的病例100例，其中男50例，女50例，平均年龄45岁(7～87岁)，中位数为47岁。所有病例都是血液病或肿瘤化疗后引起的PLT减低的患者[4]。空腹抽取静脉血2 mL置于含乙二胺四乙酸二钾(EDTA－K2)抗凝剂的真空管中，所有检测均在标本采集后2 h内完成。剔除所有仪器提示有PLT聚集警示，或者有其它干扰警示(如冷凝集或PLT异常分布等)的检测样本的结果。

二、仪器和试剂

1.仪器美国雅培公司CELL－DYN SAPPHIRE全自动血液分析仪，Leica光学显微镜，改良牛鲍细胞计数板，20 μL微量采血管，美国BD公司EDTA－K2真空采血管。

2.试剂CELL－DYN SAPPHIRE原装进口配套试剂、原装CELL－DYN 29 Plus Control(with Retic)质控品(level－L、N、H)，原装CELL－DYN Immuno PLT(CD61)单克隆试剂管，PLT稀释液使用10 g/L草酸铵溶液，按《全国临床检验操作规程(第三版)》[5]配制，并于4℃冰箱保存。

三、试验方法

1.仪器经培训考核合格的人员操作，测定时仪器在校准期内，并按要求进行重复性、精密度、携带污染率试验[10]，同时用配套低、中、高值3种质控品进行质控检测。以确保各自仪器性能的稳定。

2.CD61免疫学法、光学法和电阻抗法测定的重复性分别为1.40%、1.52%和2.44%，携带污染率分别为0.113%、0.135%和0.233%，均符合仪器技术指标要求[6]。精密度的测定，选取3个PLT(低、中、高值)样本，分别使用3种方法计数，测定10次，测得PLT的、s、CV。

3.CD－SAPPHIRE血液分析仪的计数法(电阻抗法、光学法、CD61免疫学法)EDTA－K2抗凝管采集空腹静脉血后，按照制造商说明书要求，在CELL－DYN SAPPHIRE分析仪执行全血测定，并使用3种方法来检测PLT，即电阻抗法、光学法和CD61免疫学法。电阻抗法和光学法在仪器的常规模式下同时完成检测，即“CBC模式”。CD61免疫学法在仪器的特殊模式下完成检测，即“CBC+ CD61模式”。进样模式均采用闭合自动进样模式。

4.PLT计数参考方法(手工法)该法为世界卫生组织(WHO)推荐[6－8，11]。按《全国临床检验操作规程(第3版)》[5]操作。手工法由2名主管及以上老师双盲法完成计数，结果取2次结果的均值(误差＜5%)。所有操作均在2 h内完成。

四、统计学方法

以PLT手工计数法(MPLT)为对照组，使用单因素方差分析，来检验4组均值差异是否有统计学意义，然后再使用Dunnett检验分别检验MPLT与电阻抗法、光学法、CD61免疫学法的PLT均值是否存在明显差异;使用线性回归分析，分别计算MPLT与电阻抗法、光学法、CD61免疫学法之间的皮尔森相关系数(r)、确定系数(R2)，来分别确定它们之间的线性相关性;使用BLANDALTMAN分析来评估均值偏差，分别计算MPLT法与电阻抗法、光学法、CD61免疫学法的均值差、标准差、95%可信区间的差异;然后以手工法PLT计数为参考方法，通过秩和检验分析临床上依据电阻抗法、光学法、CD61免疫学法的PLT结果进行不合理PLT输注的发生频率。以上所有的统计分析均使用Microsoft Office Excel 2012、MedCalc V12.7.2.0和SPSS 13.0软件完成。

结果

一、电阻抗法、光学法和CD61免疫学法PLT精密度测定结果

结果显示均具有较好的精密度，变异系数(CV)均＜4.0%，符合仪器技术指标要求[6]。见表1。

二、手工法与CD61免疫学法、光学法和电阻抗法PLT计数的比较

共收集100份样本。在CD－SAPPHIRE自动分析仪进行检测时，分别得到电阻抗法结果82例(82%)，光学法结果100例(100%)，CD61免疫学法PLT结果100例(100%)，其中电阻抗法PLT计数有18例(18%)仪器未提供结果。在仪器检测的同时，MPLT计数PLT，获得结果100例(100%)。MPLT、电阻抗法、光学法、CD61免疫学法PLT的±s分别为(25.14±12.73)×109/L、(35.11±13.68)×109/L、(26.45±13.06)×109/L、(25.12±12.72)×109/L。

运用SPSS19.0软件进行Kolmogorov－Smirnov test分析，4组数据P均＞0.05，无明显线性偏离，显示呈近正态分布。MPLT(100例)、电阻抗法(82例)、光学法(100例)、CD61免疫学法PLT (100例)P值分别为0.596、0.706、0.755、0.801。

运用SPSS 19.0软件对4组PLT结果均值进行ANOVA分析:Levene=0.915，P=0.434，所以方差齐;F=10.212，P=0.000，4组均值差异有统计学意义;再行Dunnett检验进行两两之间的比较，发现MPLT与电阻抗法的均值差异有统计学意义(P =0.000)，MPLT与光学法的均值差异有统计学意义(P=0.002)，MPLT与CD61免疫学法的均值差异无统计学意义(P=0.915)。

运用MedCalc V12.7.2.0软件，以MPLT为参照，分别与电阻抗法、光学法、CD61免疫学法PLT进行相关性分析、Passing－Bablok回归分析和Bland－Altman偏倚分析。结果见表2。电阻抗法、光学法、CD61免疫学法PLT及MPLT的PLT计数之间均无明显线性偏离(P均＞0.05)，但光学法(r =0.946)、CD61免疫学法PLT(r=0.998)的线性相关性明显好于电阻抗法(r=0.845)。见表2。

电阻抗法、光学法、CD61免疫学法PLT与MPLT进行Passing－Bablok回归分析，回归方程分别为Y=－1.066 7+1.266 7X，Y=0.650 0+ 1.000 0X，Y=－0.150 0+1.000 0X。因斜率的95%CI不包含1，说明真实斜率与理论值1之间有明显不同，则2组数据之间存在明显的比例量系统误差，所以电阻抗法(斜率为1.27，95%CI为1.10～1.44)与手工法PLT计数差异有统计学意义，而光学法(斜率为1.0，95%CI为0.95～1.06)和CD61免疫学法PLT(斜率为1.0，95%CI为0.99～1.01)与MPLT PLT计数均无明显差异。见图1～3。

对电阻抗法、光学法、CD61免疫学法PLT与MPLT进行Bland－Altman偏倚分析。CD61免疫学法PLT(Mean difference=－0.02，P=0.70)与MPLT PLT计数无明显偏倚，而光学法(Mean difference=1.3，P=0.70)和电阻抗法(Mean difference=6.3，P=0.16)与MPLT PLT计数均有轻度偏倚，但电阻抗法的偏倚程度明显高于光学法。

为了评估实验室提供的不准确的PLT计数值对临床的影响，我们先假定世界卫生组织(WHO)推荐的MPLT PLT计数值最为接近患者真值，把参照MPLT PLT进行的PLT预防性输注，分别与参照自动分析仪提供的电阻抗法、光学法、CD61免疫学法PLT进行的输注患者的例数进行比较。然后设定4个等级的PLT输注阈值: 5×109/L，10×109/L，20×109/L和50×109/L;临床上依据自动分析仪PLT结果(3种测定方法)进行PLT预防性输注，导致的输注不足和输注过度情况，见表3～5。

H检验显示电阻抗法、光学法与MPLT比较，PLT阈值为50×109/L组的输注不合理情况和其它各组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。而CD61免疫学法与MPLT比较，不同PLT阈值各组之间差异均无统计学意义(P＞0.05)。

讨论

CELL－DYN SAPPHIRE血液分析仪PLT检测方法在保留了传统的库尔特原理外，还采用了双维度多角度散射光检测计数，并利用免疫学原理和流式细胞术相结合的技术使用CD61免疫学PLT计数法[10]。本试验在保证分析仪3种PLT检测法重复性、携带污染率、精密度均合格的基础上，主要研究该仪器3种方法在低值PLT检测方面的优劣性。通过ANOVA分析发现，MPLT与CD61免疫学法PLT计数均值无显著性差异，但与电阻抗法、光学法PLT计数的均值差异有统计学意义(表1)。通过PASSING－BABLOK回归分析发现，除电阻抗法外，光学法和CD61免疫学法与MPLT PLT计数的相关性均较好，且CD61免疫学法要优于光学法(图1～3)。通过偏倚分析发现，与MPLT相比，电阻抗法比光学法的偏倚更加显著，而CD61免疫学法与MPLT之间无显著偏倚(图1～3)。文献中得知[11－15]，电阻抗法由于方法学局限，不能很好地把血液中非PLT颗粒从PLT中精准的区别开来;光学法虽提高了PLT甄别的灵敏度，但却因受到颗粒体积的限制，对大PLT检测无能为力;而CD61免疫学法因为利用PLT表面特有物质——表面糖蛋白Ⅲa，使用单克隆抗体特异性标记PLT，可以有效排除血液中“非PLT颗粒”的干扰，获得更为准确的PLT结果。本研究所用样本主要来源于血液病或者化疗后患者，该群体血液中更可能存在红细胞碎片、白细胞凋亡颗粒等非PLT干扰颗粒，从而使得实验结果更有代表性，更能反映3种方法之间的优劣性。

临床医生在进行PLT预防性输注(prophylactic platelet transfusions，PPT)干预时，如PLT计数不准确有可能会发生“PLT输注不足”与“PLT输注过度”的输注情况。“PLT输注不足”是指:临床医生依据实验室提供的假性增高的PLT数值(真值低于输注阈值)，对本该进行输注治疗的患者未进行输注，造成治疗的延误;“PLT输注过度”是指，临床医生依据实验室提供的假性减低的PLT数值(真值高于输注阈值)，对本不该进行输注治疗的患者进行了不必要的输注，造成经济上或医疗资源的浪费。在一些研究中，自动化血液分析仪由于方法学局限，可能会出现一些假性增高的PLT结果，对临床预防性PLT输注可能存在潜在影响[16－17]。从表3～5可知，因电阻抗法PLT会明显高于实际值，当使用较低PLT输注阈值时，会导致患者PLT输注不足，只有当阈值升至50×109/L时，才能减低PLT输注不足的情况发生，但同时可能导致一些患者过度输注和医疗资源的浪费。光学法的情况稍好，但也不容乐观，当阈值为5×109/L、10×109/L或20×109/L时，仍有20%以上输注不足的情况。如能依据CD61免疫学法PLT值进行PLT输注，即使PLT值下降到5 ×109/L，也可基本保证临床干预治疗的正确性。因为准确检测低值PLT的困难性客观存在，临床医生应对不准确PLT导致的PLT输注不足的情况引起重视，也应对临床实验室采用何种方法检测PLT有充分了解，这样才能根据实际情况，制定合适的预防性PLT输注阈值，给患者带来积极、正确的干预治疗。虽然PLT的过度输注并不会对患者带来致命伤害，但从减轻患者的经济负担、减低输血带来的感染风险、减少医疗资料的浪费方面有着积极的医学意义。本研究结果提示，临床实验室在低值PLT检测中，尤其对于血液病或肿瘤化疗后患者，应避免使用电阻抗法计数，虽光学计数法可接受，但在有条件的情况下，宜采用CD61免疫学计数法，为临床提供一个更可靠的试验数据。

[1]HONG KH，KIM MJ，LEE KW，et al.Platelet count evaluationusingthreeautomatedhaematology analysers compared with the immunoplatelet reference method，and estimation of possible inadequate platelet transfusion[J].Int J Lab Hematol，2009，31(3): 298－306.

[2]KUNICKA JE，FISCHER G，MURPHY J，et al.Improved plateletcountingusingtwo－dimensional laser light scatter[J].Am J Clin Pathol，2000，114 (2):283－289.

[3]魏晴，田兆嵩.血小板的临床应用[J].中国输血杂志，2008，21(9):732－734.

[4]InternationalCouncilforStandardizationin HaematologyExpertPanelonCytometry，International Society of Laboratory Hematology Task Force on Platelet Counting.Platelet counting by the RBC/platelet ratio method.A reference method[J].Am J Clin Pathol，2001，115(3):460－464.

[5]叶应妩，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程[M].3版.南京:东南大学出版社，2006:136－ 137.

[6]丛玉隆.今日临床检验学[M].北京:人民军医出版社，1998:24－32.

[7]丛玉隆.现代血细胞分析技术与临床[M].北京:人民军医出版社，2005:50－52.

[8]胡丽华.临床输血检验[M].北京:中国医药科技出版社，2004:271.

[9]罗丽贞，叶金峰，刘伟阳.XE－5000血细胞分析仪血小板计数性能评价[J].检验医学与临床，2011，8(4):400－402.

[10]GILL JE，DAVIS KA，COWART WJ，et al.A rapid and accurate closed－tube immunoassay for platelets on an automated hematology analyzer[J].Am J Clin Pathol，2000，114(1):47－56.

[11]ENGLAND JM，ROWAN RM，BINS M，et al.Recommended methods for the visual determination of white cell and platelet counts[EB/OL].http:// whqlibdoc.who.int/hq/1988/WHO_LAB_88.3.pdf

[12]AKWARI AM，ROSS DW，STASS SA.Spuriously elevated platelet counts due to microspherocytosis[J].Am J Clin Pathol，1982，77(2):220－221.

[13]CORNBLEET J.Spuriously elevated platelet counts due to miscospherocytosis[J].Lab Med，1983，14: 509－512.

[14]HAMMERSTROM J.Spurious platelet counts in acute leukaemia with DIC due to cell fragmentation[J].Clin Lab Haematol，1992，14(3):239－243.

[15]PATERAKISG，KONSTANTOPOULOSK，LOUKOPOULOS D.Spuriously increased platelet count due to microcyte interference:value of the R－1000(Sysmex)reticulocyte analyzer[J].Am J Hematol，1994，46(1):57－58.

[16]SEGAL HC，BRIGGS C，KUNKA S，et al.Accuracy of platelet counting haematology analysers in severe thrombocytopenia and potential impact on platelet transfusion[J].Br J Haematol，2005，128(4):520－525.

[17]NISHIYAMA M，HAYASHI S，FUTSUKAICHI Y，et al.Usefulness of immunoplatelet measurement using the flow cytometric method for accurate platelet countinginhematologicalpatientswithsevere thrombocytopenia[J].Rinsho Byori，2004，52(2): 103－108.

Comparison and application of low platelet counts by CD61 immunological，optical，electrical impedance methods of CELL-DYN Sapphire hematology analyzer

ZHANG Chi1，ZHANG Hongbo2.(Department of Clinical Laboratory，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Hubei Wuhan 430030，China)

ObjectiveTo evaluate and compare the advantages and disadvantages of 3 detection methods of CELL－DYN Sapphire hematology analyzer in the aspect of low platelet(PLT)detection.MethodsA total of 100 patients whose platelet＜50×109/L caused by basis hematonosis or after chemotherapy were enrolled.PLT counts were determined by electrical impedance method(IPLT)，optical method(OPLP)and CD61 immunological method (CD61－PLT).The results were analyzed comparatively with those of manual microscopy.Variance analysis，Passing－Bablok regression analysis and Bland－Altman bias analysis were performed by SPSS 19.0 and MedCalc V12.7.2.0 softwares statistically.ResultsANOVA analysis showed that there was statistical significance for IPLT and OPLT with manual method(MPLT).(P=0.00，P=0.002).CD61－PLT and MPLT had no statistical significance(P=0.915).OPLT and CD61－PLT had good correlation with MPLT without statistical significance[slope 1.0，95%confidence interval(CI):0.95－1.06，r=0.946 and slope 1.0，95%CI:0.99－1.01，r=0.998].IPLT had poor correlation with MPLT with statistical significantce(slope 1.27，95%CI:1.10－1.44，r=0.845).According to variance analysis，the values of IPLT and OPLT were higher than those of MPLT(mean deviations were 6.3 and 1.3).CD61－PLT and MPLT had no significant difference(mean deviation was－0.02).ConclusionsIPLT has significantly statistical difference with MPLT for low PLT determination，with poor correlation，and the result has a significant upward deviation.The means of OPLT and MPLT have statistical significance with good correlation，but the result has a still small upward deviation.The CD61－PLT and MPLT have no obvious difference with a good correlation，and the results are not significantly different.Therefore，it is recommended that we can use CD61－PLT as a new reference method and OPLT and IPLT as alternative methods.

Low platelet;CD61 immunological method;Optical method;Electrical impedance method; CD－SAPPHIRE;Prophylactic platelet transfusion

1673－8640(2015)03－0274－06

R446.11

A

10.3969/j.issn.1673－8640.2015.03.018

2014－07－03)

(本文编辑:范基农)

张驰，男，1980年生，硕士，主管技师，主要从事感染免疫学相关研究。