16SrRNA测序法鉴定致皮下软组织感染的毗邻颗粒链菌一例

卫颖珏， 杨海慧， 秦娟秀

(上海交通大学医学院附属仁济医院，上海200001)

颗粒链菌属(Granulicatella)为兼性厌氧的革兰阳性球菌，是人口咽部、泌尿生殖道和肠道的正常菌群，机体免疫力低下时可引起感染性心内膜炎、中耳炎和菌血症等。我们近期从1例无肌性皮肌炎患者右上肢皮疹溃疡中分离出1株毗邻颗粒链菌(Granulicatella adiacens)，现报道如下。

一、病例资料

患者男，64岁，因“确诊无肌性皮肌炎3年”于2014年7月7日入住上海仁济医院风湿科病房。患者主诉自2010年10月开始出现额部、面颊、鼻、颈背部、手指关节伸侧紫红色斑疹，无瘙痒，无关节肿痛，无肌力下降，无肌痛，上海华山医院2011年1月查抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)阳性1∶3 200，抗 Ro52 阳性(+++)，抗干燥综合征抗原A抗体、抗干燥综合征抗原B抗体阴性，予强的松和羟氯喹治疗，症状改善。之后患者病情反复，仍有四肢及面部红色斑疹。现予以强的松 25 mg/d+羟氯喹 0.2/d、甲氨蝶呤10 mg/周治疗，患者右上肢皮疹仍红肿胀痛。

查体:体温 37℃，脉搏 84次/分，呼吸18次/分，血压 17.3/9.3 kPa，右手背肿胀明显。血常规:白细胞7.2×109/L，中性粒细胞70.2%。右手背肿胀处溃疡分泌物细菌涂片发现短链状革兰阳性球菌，医嘱行分泌物培养。

二、微生物学检查及结果

1.细菌培养 用无菌拭子采集患者右手背肿胀处溃疡分泌物，接种血平板、麦康凯平板和巧克力平板(上海伊华医学科技有限公司)，35℃、5.5%CO2培养24h后，血平板上形成灰白色α溶血的细小菌落。其它平板上无细菌生长。

2.细菌鉴定 (1)染色镜检:将24h培养物涂片、革兰染色，镜下见卵圆形、成双或短链状排列的革兰阴性球菌;再将48 h培养物涂片染色，镜下见类似的革兰阳性球菌;(2)卫星试验:用金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)做卫星试验，结果为阳性;(3)上机鉴定:将24h培养物用法国生物梅里埃VITEK 2 Compact系统NH板条鉴定，结果为阴道加德纳菌89%，生物编码0237610010。

3.16SrRNA基因测序 鉴于该菌革兰染色阴阳性不定，上机鉴定率不高且与实际所送标本不符，故应用16SrRNA基因测序法进一步鉴定。采用天根生化试剂盒提取细菌DNA作为模板待用。参考引物序列如下:16S rRNA上游引物(F):5'-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，16S rRNA下游引物(R):5'-GGTTACCTT-GTTACGACTT-3'。PCR扩增反应体系为:10×Buffer缓冲液2.5μL;dNTPMix 2μL;TaqDNA聚合酶0.5μL;DNA模板1μL;上下游引物各1μL;ddH2O 17μL;聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增条件为:94℃ 5 min;94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃90 s，32个循环;72℃ 10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。将PCR产物送铂尚生物技术(上海)有限公司测序，所得序列在NCBI上进行比对。经序列比对后，鉴定该菌为毗邻颗粒链菌99%，GenBank序列号AY879299.1。

4.诊断与治疗 由于该菌表型鉴定困难，至患者出院时细菌鉴定的最终结果仍未报告，也未做药物敏感性试验［可根据美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)MM45-A2标准进行药物敏感性试验］。临床医生经验性地先后给予左氧氟沙星、异烟肼、美罗培南和多西环素治疗，患者出院时右手背皮下软组织感染有所好转，但仍有肿胀。

三、讨论

1961年FRENKEL等［1］将一种在其它细菌菌落周围呈“卫星现象”生长的草绿色链球菌定义为营养变异链球菌(nutritionally variant Streptococcus，NVS)。2000年 COLLINS 等［2］应用16SrRNA基因序列研究将NVS重新分为颗粒链菌属和乏养菌属(Abiotrophia)，其中颗粒链菌属包括毗邻颗粒链菌、挑剔颗粒链菌(Granulicatella elegans)、小须鲸颗粒链菌(Granulicatella balaenopterae)和副毗邻颗粒链菌(Granulicatella para-adiacens)。

颗粒链菌属对营养要求挑剔，通常只能在含有L-半胱氨酸或吡哆辛的培养基上生长。一般认为“吡哆辛依赖试验”和“卫星现象”是关键的手工鉴定方法。目前多应用自动化系统来鉴定该菌属。VITEK 2 Compact系统是新一代的全自动快速微生物鉴定智能分析系统，该系统的GP板条菌种库中有该菌属。但由于该菌属革兰染色的不确定性，选用正确的板条上机显得尤为重要。

16SrRNA基因测序法相比其它细菌表型鉴定方法具有高效、准确、特异性强等优点。随着基因组学的迅猛发展，细菌16S rRNA间隔区序列数据库不断扩大，使该技术已成为细菌分类学中最重要的方法［3］。2014年KOH等［4］先用VITEK 2 Compact系统，再用16S rRNA基因测序来验证的方法鉴定出3株毗邻颗粒链菌。因需特殊仪器并外送测序等原因，该技术目前还不作为常规的鉴定方法，多用于对全自动鉴定系统的验证或科学研究。

临床治疗颗粒链菌属所致感染较为困难［5］，可能是其对一些抗菌药物耐药。表型鉴定的低检出率和耗时过长也增加了诊断及治疗的难度。本例患者长期服用免疫抑制剂，属该菌的易感人群。由于报告滞后，临床医生先后用了4种抗菌药物，效果均一般。

对于临床微生物检验工作者而言，尽早地检出颗粒链菌将有助于临床及时诊断和治疗。普通培养基上生长不良的链球菌，要想到是NVS的可能，加做卫星试验，对鉴定有帮助。有条件的实验室可应用16S rRNA基因测序技术来帮助鉴定，防止漏检和误检。

［1］FRENKEL A，HIRSCH W.Spontaneous development of L forms of streptococci requiring secretions of other bacteria or sulphydryl compounds for normal growth［J］.Nature，1961，191:728-730.

［2］COLLINSMD，LAWSON PA.The genus Abiotrophia(Kawamura etal.)is not monophyletic:proposal of Granulicatella gen. nov.， Granulicatella adiacens comb.nov.，Granulicatella elegans comb.nov.and Granulicatella balaenopterae comb.nov.［J］.Int J Syst Evol Microbiol，2000，50(Pt 1):365-369.

［3］龙雯，陈存社.16SrRNA测序在细菌鉴定中的应用［J］.北京工商大学学报:自然科学版，2006，24(5):10-12.

［4］KOH YR， YI J， KIM HH， etal. Discrepant satellitism for identification of Granulicatella adiacens isolates［J］.Ann Lab Med，2014，34(2):174-176.

［5］BROUQUI P，RAOULT D.Endocarditis due to rare and fastidious bacteria［J］.Clin Microbiol Rev，2001，14(1):177-207.