MTHFR基因C677T和A1298C多态性与精神分裂症关联的家系研究*

周胜利刘兆云刘　苗刘金同张　燕陈　刚陈　星

作者单位:1.250062山东济南，山东省医学科学院基础医学研究所　2.济南大学、山东省医学科学院医学与生命科学学院3.山东省精神卫生中心

MTHFR基因C677T和A1298C多态性与精神分裂症关联的家系研究*

周胜利1，2刘兆云1，2刘苗1，2刘金同3张燕3陈刚1陈星1

作者单位:1.250062山东济南，山东省医学科学院基础医学研究所2.济南大学、山东省医学科学院医学与生命科学学院3.山东省精神卫生中心

【摘要】目的探讨MTHFR基因的C677T和A1298C多态位点与精神分裂症的关系。方法采用高分辨率熔解曲线对103个精神分裂症核心家系的C677T与A1298C多态性位点进行SNP分型，通过传递不平衡分析(TDT)和Log线性模型进行数据分析。结果TDT分析未发现C677T与A1298C多态性位点由杂合型亲代向患者的优势传递(P=0.753，0.492)。Log线性模型显示患者母亲MTHFR C677T与A1298C的单位点分析(C677T P=0.415，A1298C P=0.846)及单体型分析(P=0.607)均无特定亲代配型的聚集。结论MTHFR基因的C677T与A1298C位点的单核苷酸多态性与精神分裂症的发病无关。

【关键词】精神分裂症关联分析MTHFR基因单核苷酸多态高分辨率熔解曲线

精神分裂症(Schizophrenia)是以幻觉、妄想、感情淡漠、精神活动与环境不协调以及认知障碍为特征的一类严重精神障碍。世界范围终生患病率与发病率分别为0.30%～0.66%和(10.2～22.0)/100 000人年数［1］。遗传与环境被认为是导致疾病的重要因素［2］。

亚甲基四氢叶酸还原酶(Methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)在单碳循环发挥重要作用，为脱氧核苷酸碱基提供前体，另外还参与膜脂及DNA的甲基化。MTHFR定位于染色体1p36.3［3］，主要包含两个单核苷酸多态性(SNPs)，分别是C677T(rs1801133)与A1298C(rs1801131)，都可导致酶活性的改变及影响高半胱氨酸的浓度［3～5］。C677T使得丙氨酸转变为缬氨酸，A1298C引起谷氨酸转变为丙氨酸，两者都会引起亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)的活性下降，尤其是C677T多态性引起的变化更为明显。MTHFR能够使5，10-亚甲基四氢叶酸转变为5-亚甲基四氢叶酸，后者为叶酸循环的主要形式。5-亚甲基四氢叶酸可以为高半胱氨酸形成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的过程中提供甲基，S-腺苷甲硫氨酸是脑中甲基团［6］。

甲基化过程对细胞的功能影响至关重要，人体和动物实验均表明叶酸减少与高半胱氨酸的增多都可对神经系统产生有害作用［7］。MTHFR的多态性与精神分裂症关系的研究结果不一致，有研究报道其与精神分裂症有关联(Arinami T等［8］、Joober R等［9］、Sazci A等［10］、Kempisty B等［11，12］、Tan EC等［13］、Vilella E等［14］、Shi J等［15］)。有Meta分析结果则倾向于与精神分裂症有关(Lewis SJ等［16］、Jonsson EG等［17］、Muntjewerff JW等［18］、Zintzaras E等［19］、Allen NC等［20］、Gilbody S等［21］)。

本研究中，我们做了基于家系的研究来探讨MTHFR的多态性C677T和A1298C与精神分裂症的关系。通过SNP分型后，检测MTHFR C677T与A1298C从亲代向患者子代的传递与精神分裂症的关系。同时，我们还分析了母亲这两个位点的基因型对后代患精神分裂症风险的影响。

1　对象与方法

1.1对象选择山东省精神卫生中心2005～2010年住院的精神分裂症患者与其父母103家(核心家系)，其中患者与父母的3口之家88家，患者与父亲或母亲的两口之家15家;男性患者48例，女性患者55例，男女比例1∶1.14;年龄7～27岁，平均(17±3)岁，平均发病年龄(16±3)岁。所有患者的诊断分别由两名精神科医师依据国际疾病分类第十版(ICD-10)诊断标准独立做出。该研究对象均为汉族，获得了患者与父母的知情同意，并通过了山东省医学科学院基础医学研究所伦理委员会的批准。1.2方法血液采集取外周静脉血，EDTA抗凝后置于－20℃保存; DNA提取采用离心柱型全血试剂盒［QuickGene SP kit DNA whole blood (SP-DB )，FUJIFILM］。DNA浓度测定使用NanoDrop ND-2000 UV/V分光光度计进行浓度测定，每个样本测定两次，取其平均值;如果两次误差超过10%，则进行第3次测定，然后取两个相近数值的平均值，最后将所有DNA样品稀释至终浓度10 ng/μl。MTHFR的序列由UCSC (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)数据库取得，C677T与A1298C的引物设计由USCS的在线PCR引物设计完成(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr? org=Human＆db=hg19＆hgsid=257542227)。C677T位点的正向与反向引物分别为: 5’-ACTTGAAGGAGAAGGTGTCTG-3’与5’-GGAAGAATG TGTCAGCCTCAA-3’。A1298C位点的正向与反向引物分别为: 5’-AAGGAGGAGCTGCTGAAGATG-3’与5’-CCGAGAGGTAAAGAACGAAGACT-3’。SNP分型采用高分辨率熔解曲线(High Resolution Melting，HRM)。PCR程序设置为94℃预变性5 min，继变性94℃30 s，退火和延伸59℃1 min，共50个循环，4℃保温。HRM过程采用LightScanner(HRM高分辨率熔解曲线)突变检测/基因分型分析系统，温度为65℃→90℃。纯合子与杂合子由HRM曲线的不同得以区分，而纯合子野生型与突变型由Tm值的差异而区分，进而得到相关位点的准确分型。

1.3统计学方法使用Haploview 4.2统计软件对MTHFR基因的C677T与A1298C多态性位点进行哈迪－温伯格平衡检测(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)及传递不平衡检测(Transmission Disequilibrium Tests，TDT)。检验水准均设为0.05。传递不平衡检测1993年由Spielman提出，当来源于杂合双亲的等位基因在遗传给患病后代时的概率显著偏离随机概率时，则提示该位点与疾病连锁或关联［22］。另外，应用对数线性模型(log-linear model)分析核心家系的数据来评估母源因素对后代表型的影响［23］。每个家系通过个体中携带风险基因的数量分类，M，F，C(0，1，2)分别是母亲、父亲、孩子所携带风险基因的个数。之后通过似然比检验(Likelihood Ratio Test，LRT)来评估母亲所携带的基因型对后代患病的风险的影响。P值为双尾，检验水准为0.05，模型如下: ln［E(nM，F，C)］=γj+α1I{ M=1}+α2I{ M=2}+β1I{ C=1}+β2I{ C=1}+ ln(2)I{ M=F=C=1}

2　结果

2.1Hardy-Weinberg平衡分析及传递不平衡检测多态性位点C677T与A1298C位点均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)，见表1。两点间的D’=0.873(95%CI: 0.72～0.95)，R2=0.195。在传递不平衡检测中，多态性位点C677T与A1298C位点传递/非传递的碱基分别是47/44(P=0.753)和29/24(P=0.492)，单个位点未发现传递差异具有统计学意义(P ＞0.05)。见表2。

2.2单倍型分析及似然比检验利用对数线性模型，首先分别单独检测C677T与A1298C位点，结果显示均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)。LRT结果显示分别为C677T(LRT P值=0.415，df=4)A1298C (LRT P值=0.846，df=4)。之后构建母亲C677T与A1298C的单倍型A-C、C-C、A-T，其检测结果见表3及图1。单倍型LRT P值=0.607，df=10，无论单个位点或C677T与A1298C所构建的单倍型均未显示母亲MTHFR基因型对后代精神分裂症的患病风险有所影响［24］。

3　讨论

许多病例-对照研究提示MTHFR基因可能与精神分裂症的发病相关，然而在不同的实验中并没有得到一致的结论。病例-对照研究容易受到人群分层因素的影响，而家系研究则能规避这点，因此，在重复验证病例-对照研究发现时逐渐被应用［24］。本研究通过对精神分裂症患者核心家系的MTHFR多态性位点分型后进行传递不平衡检测(TDT)，显示C677T与A1298C位点在杂合双亲向患精神分裂症子代的传递中是随机的。这与Muntjewerff JW等［25］在2007年的家系研究结果相一致。

病例-对照研究容易受到人群分层因素的影响，而这也部分解释了不同地区与不同实验的结果差异。但病例-对照研究的样本数量一般较家系研究要大很多，虽然家系研究能避开人群分层因素的影响，但其检验效能往往不及病例-对照研究。且TDT检测只能利用到双亲是杂合型的遗传信息，这些都可能是影响其检验能力的因素。另外，也有研究认为母体在怀孕时的叶酸与高半胱氨酸浓度异常会影响胎儿的神经系统发育，从而增加孩子患精神分裂症的风险。如果是这样，那么母亲的基因型则应是我们的关注对象［26］。Zhang C等［27］在2010年的家系研究中发现母亲A1298C的多态性影响后代精神分裂症的发病。其在母亲基因型与患者发病关系的研究中引入了正常人的母亲作为对照，而为了规避分层因素等风险，本研究选择了对数线性模型。而结果显示无论单个位点或C677T与A1298C所构建的单倍型均未显示母亲MTHFR基因型对后代精神分裂症的患病风险有所影响。

我们的研究显示MTHFR的677T与1298C在双亲向精神分裂症患者后代的传递中并未呈现优先传递现象。在精神分裂症患者母亲的基因型中也未发现C677T和A1298C单个位点以及其所构建的单倍型有过度聚集现象。同时，由于本研究受到样本量的限制，且未将母亲在孕期内的环境因素(如叶酸摄入量等)纳入研究范围，重复试验及MTHFR基因与精神分裂症关系的进一步研究仍是必要的。

参考文献

［1］McGrath J，Saha S，Chant D，et al.Schizophrenia: a concise overview of incidence，prevalence，and mortality［J］.Epidemiol Rev，2008，30: 67－76

［2］Tsuang M.Schizophrenia: genes and environment［J］.Biol Psychiatry，2000，47(3): 210－220

［3］Goyette P，Sumner JS，Milos R，et al.Human methylenetetrahydrofolate reductase: isolation of cDNA mapping and mutation identification［J］.Nat Genet，1994，7(4): 551

［4］van der Put NM，Gabreels F，Stevens EM，et al.A second common mutation in the methylenetetrahydrofolate reductase gene: an additional risk factor for neural-tube defects?［J］.Am J Hum Genet，1998，62(5): 1044－1051

［5］Hazra A，Kraft P，Lazarus R，et al.Genome-wide significant predictors of metabolites in the one-carbon metabolism pathway［J］.Hum Mol Genet，2009，18(23): 4677－4687

［6］Catoni GL.S-Adenosylmethionine: a new intermediate formed enzymatically from L-methionine and adenosinetriphosphate ［J］.J Biol Chem，1953，204(1): 403－416

［7］Mattson MP，Shea TB.Folate and homocysteine metabolism in neural plasticity and neurodegenerative disorders［J］.Trends Neurosci，2003，26(3): 137－146

［8］Arinami T，Yamada N，Yamakawa-Kobayashi K，et al.Methylenetetrahydrofolate reductase variant and schizophrenia/depression［J］.Am J Med Genet，1997，74(5): 526－528

［9］Joober R，Benkelfat C，Lal S，et al.Association between the methylenetetrahydrofolate reductase 677C--＞T missense mutation and schizophrenia［J］.Mol Psychiatry，2000，5 (3): 323－326

［10］Sazci A，Ergul E，Guzelhan Y，et al.Methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphisms in patients with schizophrenia ［J］.Brain Res Mol Brain Res，2003，117(1): 104－107

［11］Kempisty B，Bober A，Tuczak M，et al.Distribution of 1298A＞Cpolymorphismof methylenetetrahydrofolate reductase gene in patients with bipolar disorder and schizophrenia［J］.Eur Psychiatry，2007，22(1): 39－43

［12］Kempisty B，Mostowska A，Gorska I，et al.Association of 677C＞T polymorphism of methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR)gene with bipolar disorder and schizophrenia ［J］.Neurosci Lett，2006，400(3): 267－271

［13］Tan EC，Chong SA，Lim LC，et al.Genetic analysis of the thermolabile methylenetetrahydrofolate reductase variant in schizophrenia and mood disorders［J］.Psychiatr Genet，2004，14(4): 227－231

［14］Vilella E，Virgos C，Murphy M，et al.Further evidence that hyperhomocysteinemia and methylenetetrahydrofolate reductase C677T and A1289C polymorphisms are not risk factors for schizophrenia［J］.Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2005，29(7): 1169－1174

［15］Shi J，Gershon ES，Liu C.Genetic associations with schizophrenia: meta－analyses of 12 candidate genes［J］.Schizophr Res，2008，104(1－3): 96－107

［16］Lewis SJ，Zammit S，Gunnell D，et al.A meta-analysis of the MTHFR C677T polymorphism and schizophrenia risk ［J］.Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet，2005，135B(1): 2－4

［17］Jonsson EG，Larsson K，Vares M，et al.Two methylenetetrahydrofolate reductase gene (MTHFR)polymorphisms，schizophrenia and bipolar disorder: an association study ［J］.Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet，2008，147B(6): 976－982

［18］Muntjewerff JW，Kahn RS，Blom HJ，et al.Homocysteine，methylenetetrahydrofolate reductase and risk of schizophrenia: a meta-analysis［J］.Mol Psychiatry，2006，11(2): 143－149

［19］Zintzaras E.C677T and A1298C methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphisms in schizophrenia，bipolar disorder and depression: a meta-analysis of genetic association studies［J］.Psychiatr Genet，2006，16 (3): 105－115

［20］Allen NC，Bagade S，McQueen MB，et al.Systematic meta-analyses and field synopsis of genetic association studies in schizophrenia: the SzGene database［J］.Nat Genet，2008，40(7): 827－834

［21］Gilbody S，Lewis S，Lightfoot T.Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR )geneticpolymorphisms and psychiatric disorders: a HuGE review［J］.Am J Epidemiol，2007，165(1): 1－13

［22］Spielman RS，McGinnis RE，Ewens WJ.Transmission test for linkage disequilibrium: the insulin gene region and insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM)［J］.Am J Hum Genet，1993，52(3): 506－516

［23］Weinberg CR，Wilcox AJ，Lie RT.A log-linear approach to case-parent-triad data: assessing effects of disease genes that act either directly or through maternal effects and that may be subject to parental imprinting［J］.Am J Hum Genet，1998，62(4): 969－978

［24］Schaid DJ.Transmission disequilibrium，family controls，and great expectations［J］.Am J Hum Genet，1998，63 (4): 935－941

［25］Muntjewerff JW，Hoogendoorn ML，Aukes MF，et al.No evidenceforapreferentialtransmissionofthe methylenetetrahydrofolate reductase 677T allele in families with schizophrenia offspring［J］.Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet，2007，144B(7): 891－894

［26］Labuda D，Krajinovic M，Sabbagh A，et al.Parental genotypes in the risk of a complex disease［J］.Am J Hum Genet，2002，71(1): 193－197

［27］Zhang C，Xie B，Fang Y，et al.Influence of maternal MTHFR A1298C polymorphism on the risk in offspring of schizophrenia［J］.Brain Res，2010，1320: 130－134

(修回日期:2014－07－23)

Family-based association study about C677T and A1298C polymorphisms in MTHFR gene with schizophrenia

ZHOU Shengli，LIU zhaoyun，LIU Miao，et al
Laboratory of Medical Genetics，Institute of Basic Medicine，Shandong Academy of Medical Sciences，Jinan 250062，China

【Abstract】Objective To investigate the association between polymorphisms of C677T and A1298C in MTHFR gene with schizophrenia.MethodsSingle nucleotide polymorphisms of C677T and A1298C in MTHFR gene were genotyped in 103 nuclear families of schizophrenia by using high resolution melting curve.The genetic analysis was performed by using transmission disequilibrium test (TDT)and Log linear model analysis.ResultsTDT analysis showed no preferential transmission from parents heterozygous to probands with schizophrenia for C677T and A1298C (P=0.753，0.492 respectively).No significant asymmetry of parental mating type was found in single locus analysis (P value was 0.415 for C677T and 0.846 for A1298C)or haplotype analysis (P=0.607)in Log linear model of maternal datas.Conclusion Single nucleotide polymorphisms of C677T and A1298C allele in MTHFR gene is not likely to be associated with the pathogenesis of schizophrenia.

【Key words】Schizophrenia Association study MTHFR gene Single nucleotide polymorphism High resolution melting curve

(收稿日期:2014－07－04)

通讯作者:陈星，E-mail: cx27295@foxmail.com

*基金项目:国家自然科学基金项目(编号: 30440042，30770780);山东省自然科学基金项目(编号: ZR2013HM078);山东省科技发展计划项目(编号:2011GSF11821);山东省医学科学院项目(编号:2012－25)

doi:10.3969/j.issn.2095－9346.2015.02.002

【中图分类号】R749.3

【文献标识码】A

【文章编号】2095－9346(2015)－02－0085－04