一种霉菌产的人参皂苷酶水解Rb1和Rb2皂苷糖基的机理

张天杨，刘春莹，鱼红闪，金凤燮(大连工业大学生物工程学院，辽宁大连　116034 )

一种霉菌产的人参皂苷酶水解Rb1和Rb2皂苷糖基的机理

张天杨，刘春莹，鱼红闪，金凤燮
(大连工业大学生物工程学院，辽宁大连116034 )

摘要:利用TLC法确定了一种霉菌产的特异人参皂苷酶水解Rb1和Rb2人参皂苷糖基的机理。结果表明，水解人参皂苷Rb1和Rb2的糖基种类和位置不同。水解Rb1皂苷时，先水解其20-O-β-(1→6) -葡萄糖苷键生成Rd，再依次水解Rd上2个3-O-β-(1→2) -葡萄糖苷键生成F2及终产物C-K;但在水解Rb2时，先水解其3-O-β-(1→2) -葡萄糖苷键生成C—O，再依次水解3-O-β-(1→2) -葡萄糖苷键和20-O-α-(1→6) -阿拉伯糖苷键生成C-Y和C-K。

关键词:特异人参皂苷酶;人参皂苷Rb1、Rb2;薄层层析法

0　引言

人参皂苷是人参的主要活性成分之一。天然存在的人参皂苷不一定是人参的最佳药效成分，需经肠道菌将其转化成活性更佳的成分，但这种转化受个体体质的限制明显［1］。本课题组多年致力于研究人参皂苷的生物转化，已发现并报道了多种人参皂苷酶［2-4］。本论文旨在通过研究人参皂苷Rb1和Rb2在人参皂苷酶作用下的水解机理，为今后人参皂苷的定向转化奠定一定的理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

人参皂苷标准品Rb1、Rb2、Rd、C-O、F2、C-Y、C-K，本实验室提供;霉菌产人参皂苷酶，本实验室提供;薄层层析板Silica gel 60-F254;高效液相色谱仪。

1.2方法

1.2.1酶的提纯

将该种霉菌发酵所产的粗酶，通过DE-52离子交换树脂分离纯化后，将酶活力高的组分在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)中进一步纯化。分离胶质量分数10%，电压120 V，考马氏亮蓝染色。对照染色后的胶，将在未染色的凝胶上该酶带的位置割下，捣碎溶于0.02 mol磷酸缓冲液(pH 6.7)，离心除去不溶性沉淀，获得的酶利用SDS-PAGE法确定电泳单点，再用高效液相色谱法确定是否单峰，确定为纯酶。

利用Waters 2695高效液相色谱分析仪，Waters 2996二极管阵列检测器及Empower色谱工作站检测蛋白;色谱柱，日本TOSOH TSK(Φ7.8 mm ×300 mm)流动相为0.02 mol/L(pH 6.7)磷酸缓冲液(含0.05%叠氮化钠)。进样量，100 μL;柱温，35℃;体积流量1.0 mL/min;检测波长，280 nm。

用SDS-PAGE法测定该酶的相对分子质量。

1.2.2底物的配制

称取110 mg的人参皂苷Rb1，溶于5 mL的已灭菌过的0.02 mol、pH 5.0的NaAc-HAc缓冲液，配制成20 mmol/L的Rb1底物溶液。同样方法配制Rb2底物溶液。

1.2.3酶反应

将2 mL底物与等体积的纯酶溶液混合，置于45℃条件下摇床反应，按不同时间，取200 μL酶反应液，并向其中加入等体积的水饱和正丁醇，终止酶反应，将反应物、产物转入正丁醇层。经薄层层析显色后，用Bandscan软件测定反应物和产物斑点比例，确定酶反应转化率(产物含量)。

1.2.4人参皂苷的检测方法

薄层层析法:反应液的正丁醇层(皂苷组分)，在硅胶板上点样，层析缸中展开，展开剂V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=7∶2.5∶0.5(下层) ;展开后喷10%硫酸溶液，加热显色;确定酶反应转化率。

高效液相色谱法:将Rb1和Rb2反应液(水饱和正丁醇层)蒸干，称取1 mg溶于色谱甲醇，再经0.45 μm滤膜过滤，准备进样。色谱柱，Knauer C18(5 μm，Φ250 mm×3 mm)。流动相:乙腈(A) -水(B) ;流动相比例: 0～20 min，20% A等度; 20～31 min，20%～32% A线性梯度; 31～40 min，32%～43% A线性梯度; 40～70 min，43%～100%A线性梯度;进样量，30 μL;柱温，35℃，体积流量; 0.6 mL/min;检测波长，203 nm。

2　结果与讨论

2.1酶的提纯

经SDS-PAGE法初步检测，得到单一条带;经酶蛋白高效液相色谱测定，得到单一峰，说明该酶为纯酶，相对分子质量为74 ku。

2.2Rb1水解机理

薄层层析显色结果如图1所示。由图1可以看出，Rb1几乎全部被水解，主要产物为Rd、F2和C-K等，与实验室前期的研究结果一致。经Bandscan软件测定，3种物质质量分数分别为52%、21.7%和26.3%。由此可知，酶水解Rb1的反应式如图2所示。由图2可推断出，人参皂苷Rb1在特异人参皂苷酶的作用下糖基水解的机制为:首先水解Rb1上的20-O-β-(1→6) -葡萄糖苷键生成Rd，再水解Rd上3-O-β-(1→2) -葡萄糖苷键生成人参皂苷F2，接着水解F2上的3-O-β-(1→2) -葡萄糖苷键生成C-K。

图1　特异人参皂苷酶水解Rb1的TLC图Fig.1 TLC of Rb1hydrolyzed by special ginsenosidase

图2　特异人参皂苷酶水解Rb1的反应式Fig.2 Reaction formula of Rb1hydrolysis by special ginsenosidase

2.3Rb2水解机理

薄层层析显色结果如图3所示。由图3可以看出，反应物中主要含有未反应的Rb2、产物C-O、C-Y和少量的C-K;经Bandscan软件测定，它们质量分数分别为39.8%、27.47%、29.55%和3.18%。

图3　特异人参皂苷酶水解Rb2的TLC图Fig.3 TLC of Rb2hydrolyzed by special ginsenosidase

利用高效液相色谱进行检测，结果如图4所示。从图4可以看出，反应物中主要含有未反应的Rb2、产物C-O、C-Y和少量的C-K;其Rb2、C-O、C-Y、C-K峰面积比与TLC结果相似。由此可见，人参皂苷Rb2在特异人参皂苷酶的作用下，其糖基水解的机制为:首先水解Rb2上的3-O-β-(1→2) -葡萄糖苷键生成C-O，再水解C-O的3-O-β-(1→2) -葡萄糖苷键生成C-Y，接着进一步水解C-Y上的20-O-α-(1→6) -阿拉伯糖苷键生成CK。其反应过程如图5所示。

图4　Rb2水解产物的HPLC图Fig.4 HPLC of Rb2hydrolysis products

图5　特异人参皂苷酶水解Rb2的反应式Fig.5 Reaction formula of Rb2hydrolysis by special ginsenosidase

3　结论

特异人参皂苷酶水解Rb1和Rb2最终生成C-K途径不同，水解Rb1时先水解20-O-糖基，水解Rb2时先水解3-O-糖基;但是该酶能水解Rb1和Rb2的多种糖基，属于人参皂苷酶I型。

参考文献:

［1］李翠翠，庄子瑜，刘廷强，等.转化人参二醇类皂苷为C-K的特异人参皂苷糖苷酶的纯化及性质［J］.大连工业大学学报，2010，29(1) :11-14.(LI Cui-cui，ZHUANG Zi-yu，LIU Ting-qiang，et al.Purification and characterization of the special ginsenosidase transforming protopanaxadiol ginsenosides into ginsenoside C-K［J］.Journal of Dalian Polytechnic University，2010，29(1) :11-14.)

［2］金赞敏，鱼红闪，金凤燮.人参皂甙-α-鼠李糖苷酶分离提纯及其酶性质［J］.大连轻工业学院学报，2003，22(2) :103-106.(JIN Zan-min，YU Hong-shan，JIN Feng-xie.Purification and characterization of ginsenoside-α-rhanmosidase ［J］.Journal of Dalian Institute of Light Industry，2003，22(2) :103-106.)

［3］YU Hongshan，ZHANG Chunzhi，LU Mingchun，et al.Purification and characterization of new special ginsenosidase hydrolyzing multi-glycisides of protopanaxadiol ginsenosides，ginsenosidase typeⅠ［J］.Chemical and Pharmaceutical Bulletin，2007，55(2) :231-235.

［4］YU Hongshan，JIN Fengxie，WANG Dongming，et al.Kinetics of a cloned special ginsenosidase hydrolyzing 3-O-glucoside of multi-protopanaxadiol-type ginsenosides，named ginsenosidase typeⅢ［J］.Journal of Microbiology and Biotechnology，2012，22(3) :343-351.

Hydrolysis of glycosides in Rb1and Rb2by ginsenosidase from a mold strain

ZHANG Tianyang，LIU Chunying，YU Hongshan，JIN Fengxie
(School of Biological Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China )

Abstract:The hydrolysis mechanisms of Rb1and Rb2by ginsenosidase from a mold strain were determined by TLC.The results showed that enzyme hydrolysis were related with the glycosides types and position on ginsenoside Rb1and Rb2.When hydrolyzing Rb1，the enzyme firstly hydrolyzed 20-O-β-(1→6) -glucopyranoside bond of Rb1to Rd，then hydrolyzed 3-O-β-(1→2) -glucopyranoside of Rd to F2，final to C-K.But the enzyme hydrolyzed 3-O-β-(1→2) -glucopyranoside of Rb2to C-O，then to C-Y，finally hydrolyzed 20-O-α-(1→6) -arabinoside of C-Y to C-K when hydrolyzing Rb2.

Key words:biotransformation; special ginsenosidase; ginsenoside Rb1and Rb2;TLC

作者简介:张天杨(1987-)，女，硕士研究生;通信作者:金凤燮(1945-)，男，教授.

基金项目:“重大新药创制”科技重大专项(2012ZX09503001-003).

收稿日期:2014-04-10.

文章编号:1674-1404(2015) 03-0160-03

中图分类号:TS201.2; Q946.83

文献标志码:A