中药“凤香洗液”对伴HPV感染的CIN患者宫颈局部IL-2和IL-4的影响

李小宁，贺丰杰，吉 喆

(1.陕西中医学院附属医院妇科，陕西 咸阳 712021；2.西安西电集团医院妇科，陕西 西安 710077)

中药“凤香洗液”对伴HPV感染的CIN患者宫颈局部IL-2和IL-4的影响

李小宁1，贺丰杰1，吉 喆2

(1.陕西中医学院附属医院妇科，陕西 咸阳 712021；2.西安西电集团医院妇科，陕西 西安 710077)

目的 观察中药“凤香洗液”对伴有HPV感染的CINⅠ、CINⅡ患者阴道局部免疫状态的影响及治疗效果。方法选取2013年7月至2015年2月于陕西中医学院附属医院、西安西电集团医院门诊就诊，经阴道镜下宫颈活检病理证实为CINⅠ、CINⅡ且伴有高危型HPV感染的患者共60例，其中CINⅠ30例，CINⅡ30例，对照组为同期健康体检的妇女30例。CINⅠ组接受3个疗程的“凤香洗液”治疗。应用ELISA方法测定各组人群用药前后阴道灌洗液辅助性T淋巴细胞(Th细胞)1、2细胞因子水平，其中Thl细胞因子以白细胞介素2(IL-2)表示，Th2细胞因子以IL-4表示。结果CINⅠ组、CINⅡ组患者阴道灌洗液中IL-2表达水平显著低于对照组(P＜0.01)，CINⅠ组、CINⅡ组IL-4表达水平明显高于对照组(P＜0.05)，CINⅠ组、CINⅡ组患者IL-2/IL-4比值明显低于对照组(P＜0.05)，且这些变化在CINⅡ组较CINⅠ组更明显(P＜0.05)；CINⅠ组在用药后IL-2水平较治疗前明显升高(P＜0.05)，IL-4较治疗前明显降低(P＜0.05)，IL-2/IL-4比值升高(P＜0.01)。结论CIN患者阴道灌洗液中IL-2表达下降，IL-4表达升高，IL-2/IL-4降低，且这些改变与CIN的严重程度相一致；凤香洗液可能通过调节Th1/Th2的免疫平衡来阻断疾病的进展。

凤香洗液；宫颈上皮内瘤变；人乳头瘤病毒；白介素-2；白介素-4

宫颈癌是一种感染性疾病，几乎所有的宫颈癌都和高危型HPV(HR-HPV)有关[1]。宫颈上皮内瘤变(CIN)是宫颈癌前病变，和HPV感染也密切相关，因此，有效清除HPV感染、治疗CIN甚至比治疗宫颈癌本身更有现实意义。HR-HPV的清除与阴道微环境、宫颈免疫状态密切有关。近年来关于Th亚群失衡的研究越来越受重视[2-3]，辅助性T细胞简称Th细胞，主要分为Th1细胞和Th2细胞，可以分泌多种细胞因子。IL-2属于Th1型细胞因子，IL-4属于Th2型细胞因子。正常情况下两类细胞因子处于平衡状态。机体Th1/Th2平衡一旦失调，必然介导肿瘤免疫逃逸、细菌、病毒等微生物的感染。多种中药有抗病毒、增强机体免疫力的功效，中医药防治HR-HPV感染可以阻断CIN的恶性转化[4]。从细胞因子水平分析中药治疗对阴道局部免疫的调节作用，探讨中药调动自身免疫清除病毒感染的作用机制。本研究通过测定HR-HPV感染的CIN患者阴道灌洗液中IL-2、IL-4的表达，了解CIN患者阴道局部免疫状态，同时通过中药凤香洗液对CINⅠ组患者治疗后阴道灌洗液中细胞因子的影响，从细胞因子水平分析中药治疗对阴道局部免疫的调节作用，探讨中药调节自身免疫清除病毒感染的作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年7月至2015年2月于陕西中医学院附属医院、西安西电集团医院门诊就诊，经阴道镜下宫颈活检病理证实为CINⅠ、CINⅡ且伴有高危型HPV感染并且符合下述诊断及纳入、排除标准的患者共60例(其中CINⅠ30例、CINⅡ30例)，对照组为同期健康体检的妇女30例，妇科检查及液基薄层细胞检查(TCT)无异常。本研究通过陕西中医学院附属医院伦理委员会批准，所有研究对象均自愿参加本项目，并签署知情同意书。

1.2 诊断及纳入和排除标准

1.2.1 诊断标准 参照谢幸[5]主编第八版《妇产科学》制定的诊断标准：行宫颈TCT或宫颈活组织病理学检查即可确诊。CINⅠ级为轻度异型，发生病变的细胞是上皮下的1/3层；CINⅡ级为中度异型，发生病变的细胞是上皮下的1/3～2/3。采用凯普13种高危型HPV核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒检测女性宫颈脱落细胞高危HPV-DNA定量，大于1.0×103即为阳性，可诊断高危HPV感染。

1.2.2 纳入标准 (1)年龄20～55岁，有正常性生活，常规宫颈癌前筛查经组织病理学确诊为CINⅠ～Ⅱ者并伴有HR-HPV感染；(2)就诊前3 d未同房及阴道放药；(3)未参加其他临床研究；(4)了解知情同意书。

1.2.3 排除标准 (1)怀孕中的妇女；(2)2周内未接受宫颈的其他治疗或患有其他生殖器感染性疾病；(3)免疫功能低下(患有各种免疫性疾病、恶性肿瘤、艾滋病或因免疫抑制剂导致免疫力低下等)；(4)合并严重的心脏病、肝、肾损害、血液系统相关疾病及精神病者；(5)依从性差，不能坚持治疗，或不配合随诊者。

1.3 方法

1.3.1 药物 凤香洗液(由地龙、丁香、苦参、蛇床子等七味药物组成)，由陕西中医学院制药厂提供。实验用药按要求定容，高压灭菌备用。

1.3.2 标本采集 嘱所有研究对象在3 d内不能同房，1周内勿使用抗生素，在月经干净后第3日来院。取膀胱截石位，用窥器撑开阴道，暴露宫颈，用5 ml生理盐水冲洗宫颈表面及阴道上1/3段，于后穹隆吸出灌洗液3～4 ml，剔除混有血液的标本，避免血液中细胞因子干扰试验结果。在室温下，离心5 min，2000 r/min，取上清液，置于EP管中，在-80℃的冰箱保存，备用(标本不能混有血液及反复冻融)。

1.3.3 用药方法 CINⅠ组为用药组，在月经干净第3天开始用药。用窥器暴露宫颈，用药前先如上法留取阴道灌洗液，用大棉球擦拭宫颈及阴道分泌物，将醮有凤香洗液的棉球涂擦宫颈及阴道上段，有糜烂者置浸药带线棉球，嘱患者6 h后自行取出。隔日用药1次，7次为一个疗程，连续使用3个疗程，月经期停药。治疗结束后第一次月经干净1周来院，留取阴道灌洗液行IL-2、IL-4检测。CINⅡ组需要物理治疗，故不纳入用药组。治疗期间要求性生活使用避孕套，随访期间不能阴道用药或冲洗，阴道内不使用任何药物。

1.3.4 主要试剂 IL-2、IL-4 ELISA试剂盒购自南京博尔塞生物科技有限公司。

1.3.5 检测方法 IL-2、IL-4检测采用双抗体夹心ELISA法。分别取100 μl保存的上清液样本，严格按照试剂盒的说明书要求操作，进行实验室检测，每份标本设复孔。于酶标仪上以450 nm波长测样本吸光度值，根据试剂盒提供的样本制作标准曲线，计算标本中IL-2、IL-4浓度。

1.4 统计学方法 应用SPSS17.0软件包进行统计学处理，临床资料统计采用描述性统计，IL-2、IL-4的表达强度及二者比值用均数±标准差(±s)表示，多组间的均数比较采用方差分析，两两比较采用SNK法，用药前后的均数比较采用配对t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组阴道灌洗液中IL-2和IL-4水平表达情况 各组阴道灌洗液中IL-2和IL-4的水平见表1，各组均数方差均齐。CINⅠ组和CINⅡ组患者阴道灌洗液中IL-2表达水平显著低于对照组(P＜0.01)，且CINⅡ组的降低程度较CINⅠ组更显著(P＜0.01)，不同级别CIN病变中IL-2的表达强度随宫颈病变程度的增加而降低。而CINⅠ组和CINⅡ组患者阴道灌洗液中IL-4表达水平均明显高于对照组(P＜0.05)，且CINⅡ组的升高较CIN I组更明显(P＜0.05)。不同级别CIN病变中IL-4的表达强度随宫颈病变程度的增加而增加。

表1 各组阴道灌洗液中IL-2和IL-4水平表达情况(±s)

表1 各组阴道灌洗液中IL-2和IL-4水平表达情况(±s)

注：与对照组比较，aP＜0.05，bP＜0.01；与CIN I组比较，cP＜0.05，dP＜0.01。

对照组CINⅠ组CINⅡ组F值P值30 30 30 114.8±18.4 82.6±21.3b63.6±22.1bd47.08＜0.01 61.4±22.7 78.5±27.3a93.6±22.6bc13.192＜0.05

2.2 各组阴道灌洗液中IL-2/IL-4比值比较 根据测得的IL-2、IL-4水平计算其比值，CINⅠ组和CINⅡ组患者阴道灌洗液中IL-2/IL-4水平明显低于对照组[(1.107±0.154)、(0.728±0.970)vs(1.248±0.310)，P＜0.05]，且CINⅡ组的降低程度较CINⅠ组更明显[(1.107±0.154)vs(0.728±0.970)，P＜0.05]，说明IL-2/ IL-4的比值随宫颈病变的加重而降低，与宫颈病变的严重程度呈负相关。

2.3 CINⅠ组用药前后细胞因子IL-2、IL-4水平的表达比较 CINⅠ组在用药后IL-2水平较治疗前明显升高，IL-4较治疗前明显降低，IL-2/IL-4比值显著升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 CINⅠ组用药前后细胞因子的表达比较(n=30，±s)

表2 CINⅠ组用药前后细胞因子的表达比较(n=30，±s)

用药前用药后t值P值82.6±21.3 99.6±26.4 2.664 0.010 78.5±27.3 65.9±19.7 2.050 0.044 1.107±0.154 1.308±0.158 4.989 0.000

3 讨论

宫颈癌是威胁妇女健康的第二大恶性肿瘤。已有结论表明，宫颈上皮内瘤变(CIN)是与宫颈浸润癌的发生有直接关联的一组癌前病变，而二者的发病均与高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染密切相关[6]。持续的高危型HPV(HR-HPV)感染是CIN和宫颈癌发病的首要因素[7]。研究发现，宫颈HR-HPV持续感染可贯穿宫颈癌整个发生发展过程，在机体的全身免疫状态发生改变之前，阴道及宫颈局部免疫状态已经发生改变[8]。HR-HPV持续感染可能直接影响阴道及宫颈免疫状态。

T淋巴细胞介导的免疫应答在抗肿瘤免疫的过程中起重要作用。在特异性抗原刺激下Th细胞被诱导分化成Th1、Th2两个亚群。其中Th1群细胞以表达白细胞介素-2(IL-2)、γ干扰素(IFN-γ)为主，发挥其细胞毒作用，杀死靶细胞，参加细胞免疫应答。Th2群细胞[9]以表达IL-4、IL-6、IL-10为主，主要刺激B细胞增殖产生免疫球蛋白，参与体液免疫[2]。研究发现，Thl细胞和Th2细胞在功能上相互拮抗，维持动态稳定[3]，若Thl/Th2比值向Th2偏移，可出现机体免疫状态的紊乱，随后引起感染性疾病或者肿瘤，也就是近年来提出的“Thl/Th2漂移”理论。本研究以CIN患者为研究对象，正常人群作为对照，以阴道免疫微环境为切入点，通过检测Thl、Th2代表性的细胞因子IL-2、IL-4，研究在高危HPV感染的CIN人群中是否存在“Thl/Th2漂移”现象。结果发现，在CIN患者的阴道灌洗液中IL-2的表达强度随宫颈病变程度的增加而降低，而IL-4的表达强度随宫颈病变程度的增加而增加，IL-2/IL-4比值随宫颈病变的加重而降低。可见，随宫颈病变程度的加重，Th1/Th2比值呈下降趋势，Th1向Th2的漂移越来越明显。

目前与宫颈癌防治有关的研究在西医学方面主要以抗肿瘤、抗病毒为重点。近年来开始使用HPV疫苗，但因其价格昂贵，尚未普及，且不能涵盖所有的HPV亚型。一些被公认的抗病毒药物疗效在临床上治疗效果并不确定，而中医药治疗在HPV感染方面近期取得了一定的成效，具有相当大的研发潜力。中药“凤香洗液”是我院贺丰杰教授经过长期临床摸索、实验观察，结合祖国医学理论与现代中药药理研究，研发的中药制剂。它由地龙、丁香、苦参、蛇床子等7味中药组成。已经临床验证其具有高效杀虫、抗菌、抗病毒作用。研究表明，地龙、丁香可以增强巨噬细胞的吞噬能力，蛇床子、苦参[10]能增加网状内皮细胞的吞噬功能，从而调节免疫，具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、杀虫等功效。地龙是我国传统中药材，能够治疗多种疾病，近年来开始应用于治疗免疫疾病和肿瘤。已有研究表明地龙体内可提取多种具有生物活性的物质[11-12]。地龙提取液中含有地龙素、地龙解热素、维生素B族复合体等成分，可以作为免疫调节剂，用来研制抗癌新药。研究发现这些成分可以增加胸腺、脾的重量以及细胞数目，有效消除放疗引起的T细胞免疫功能低下和辐射引起的体液免疫功能低下。可见，几味中药有一个共同的特点，即能增强免疫功能。

女性生殖道HR-HPV持续感染与阴道局部免疫功能低下有关。本研究中在用凤香洗液治疗后CINⅠ组中IL-2水平增高，而IL-4水平降低，出现IL-2/ IL-4比值的逆转，表明经过凤香洗液治疗，逆转了TH2漂移的趋势，促进Th1/Th2恢复平衡状态，改善了阴道的免疫状态，为宫颈病变向正常转化提供了有利的微环境。说明中药“凤香洗液”对宫颈局部微环境的免疫调节起到重要的作用，有望通过改善局部免疫状态达到清除HPV的目的，从病因学上阻断宫颈癌的发生，实现宫颈癌的一级预防。

[1]周 晖,卢淮武,彭永排,等.2015年NCCN宫颈癌临床实践指南[J].中国实用妇科与产科杂志,2015,3(3):185.

[2]王 倩,孙 树.宫颈癌患者外周血Th1/Th2细胞因子表达水平的研究[J].肿瘤防治杂志,2004,11(7):706-707.

[3]武 燕.宫颈癌患者Th1/Th2细胞因子表达水平的研究[J].肿瘤研究与临床,2006,18(5):310-316.

[4]张 娟,孔翊翌.萆薢止带片对宫颈高危HPV感染患者免疫调节作用临床研究[J].新中医,2012,44(7):94-95.

[5]谢 幸,苟文丽.妇产科学[M].8版.北京:人民卫生出版社, 2013:247

[6]Ciesielska U,Nowinska K,Podhorska M,et al.The role of human papillomavirus in the malignant transformation of cervix epithelial cells and the importance of vaccination against this virus[J].Adv Clin Exp Med,2012,21(2):235-244.

[7]Park in DM,Bray F,Fer lay J,et al.Estimating the world cancer burden:Globocan 2000[J].Int J Cancer,2001,94(2):153-156.

[8]刘 静,金 哲.宫颈HR_HPV感染与中医体质及阴道免疫微环境的关系[D].北京:北京中医药大学,2012.

[9]Wang HW,Joyce JA.Alternative activation of tumor-associated macrophages by IL-4[J].Cell Cycle,2010,9(24):4824-4835.

[10]耿晓星,戴智莉,王 晶.青黛紫草合剂治疗宫颈上皮内瘤变HPV感染及宫颈炎症的临床观察[J].中国中西医结合杂志,2008,11 (28):1042-1044.

[11]唐小云.地龙肽对小鼠免疫功能的影响[D].北京:中国医科大学, 2003.

[12]李兆星,陈钰妍,李顺祥.地龙的研究概况[J].湖南中医杂志, 2011,27(6):133-136.

Effects of traditional Chinese medicine“Fengxiang Lotion”on local cervical IL-2 and IL-4 in patients of cervical intraepithelial neoplasia with HPV infection.

LI Xiao-ning1,HE Feng-jie1,JI Zhe2.1.Department of Gynecology,the Affiliated Hospital of Shaanxi University of Chinese Medicine,Xianyang 712021,Shaanxi,CHINA;2. Department of Gynecology,Xi'an XD Group Hospital,Xi'an 710077,Shaanxi,CHINA

ObjectiveTo observe the effects of traditional Chinese medical compound“Fengxiang Lotion”on the local vaginal immune state for patients of cervical intraepithelial neoplasia(CIN)with human papillomavirus (HPV)infection.MethodsSixty patients with high risk HPV infection diagnosed with cervical biopsy using colposcopy in the Affiliated Hospital of Shaanxi University of Chinese Medicine and Xi'an XD Group Hospital from July2013 to February 2015 were selected in the study,which were divided into CINⅠand CINⅡgroup(n=30 each). Thirty healthy women coming for medical examination during the same period served as the control group.CINⅠgroup received Fengxiang Lotion for treatment,while the other two groups not.The levels of interleukin(IL)-2 and IL-4 in cervical-vaginal lavage solution,which were synthesized by type 1 and type 2 helper T cells respectively,were tested by ELISA.Results(1)IL-2 levels of CINⅠgroup and CINⅡgroup were significantly lower than that of the control group(P＜0.01),while IL-4 levels of CINⅠgroup and CINⅡgroup were significantly higher (P＜0.05).The ratios of IL-2 to IL-4 in CINⅠgroup and CINⅡgroup were significantly lower than that of the control group(P＜0.05).What's more,all these changes was more significant in CINⅡgroup than CINⅠgroup(P＜0.05).(2)In CINⅠgroup,the IL-2 level increased significantly after medication(P＜0.05),while IL-4 decreased significantly(P＜0.05),with the ratio of IL-2 to IL-4 increased significantly(P＜0.01).ConclusionThe IL-2 levels and IL-2/IL-4 ratio in CIN patients with HPV decreased,while IL-4 increased.These changes were consistent with the severity of CIN.“Fengxiang Lotion”may block the progression of CIN through regulating the balance of Th1 and Th2.

Fengxiang Lotion;Cervical intraepithelial neoplasia(CIN);Human papillomavirus(HPV);Interleukin-2(IL-2);Interleukin-4(IL-4)

R711.74

A

1003—6350（2015）24—3604—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.24.1303

2015-07-16)

陕西省教育厅自然科学专项（编号：2013JK0799）

贺丰杰。E-mail：hefengjiet@tom.com