杨燕澜,武宇辉,黄雀兰,李成荣,王国兵,马伟科
(深圳市儿童医院内二科,广东 深圳 518026)
前列腺素E2在川崎病患者血浆中的表达及临床意义
杨燕澜,武宇辉,黄雀兰,李成荣,王国兵,马伟科
(深圳市儿童医院内二科,广东 深圳 518026)
目的 观察前列腺素E2(PGE2)在川崎病(KD)患儿血浆中的表达水平并探讨其临床意义。方法选择2013年5月至2014年10月在我院住院的35例KD急性期患儿,在静脉注射免疫球蛋白(IVIG)治疗前后采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血浆PGE2水平,实时荧光定量PCR法测定外周血CD14+单核/巨噬细胞(MC)环氧化酶-1(COX-1)、环氧化酶-2(COX-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)水平。另选15例健康同龄儿童作为对照组,测定上述指标。结果KD急性期患儿血浆PGE2、COX-1、COX-2、TNF-α、IL-6水平均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);KD患儿中的冠状动脉病变组PGE2、COX-2水平高于无冠状动脉病变组,差异均有统计学意义(P<0.05),但COX-1、TNF-α、IL-6比较则差异均无统计学意义(P>0.05);IVIG治疗后PGE2、COX-1、COX-2、TNF-α、IL-6水平较治疗前均降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论KD急性期患儿血浆PGE2水平升高,其可能在KD的炎症免疫反应和氧化应激中发挥重要作用。
川崎病;前列腺素E2;环氧化酶-2
川崎病(Kawasaki disease,KD)又被称为黏膜皮肤淋巴结综合征(Mucocutaneous lymphnode syndrome,MCLS),是儿科常见的全身血管炎性疾病。少部分未经治疗的患儿可发生冠状动脉损害甚至形成动脉瘤。目前发病机制仍不十分清楚,流行病学及临床研究提示KD可能为感染引起的急性免疫调节紊乱,进一步导致血管壁损伤[1]。近年来,前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)在炎症反应和免疫中的作用得到越来越多的关注,在炎症急性期的血管病变可能与PGE2有关[2-3]。已经有学者关注到PGE2在川崎病患者血液中表达的改变[4-5]。本文旨在观察PGE2在KD患儿血浆中的表达水平并探讨其临床意义。
1.1 一般资料 按照国内川崎病的诊断标准[6],收集2013年5月至2014年10月在我院住院的35例初次发病的KD患儿,年龄1~7岁,平均3.72岁,男性20例,女性15例,汉族。治疗过程中心脏彩超动态观察患者冠状动脉的改变情况。若5岁以下儿童冠状动脉内径>3 mm,5岁或5岁以上儿童冠状动脉内径>4 mm;或者冠状动脉局部内径较邻近处大于或等于1.5倍者,考虑合并冠脉损伤[6]。依据心脏彩超结果把患者分为有冠脉病变组14例和无冠脉病变组21例。另外收集15例健康儿童作为对照组,年龄1~6岁,平均3.94岁,男性9例,女性6例。KD组和对照组的性别、年龄比较差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究通过医院伦理委员会的批准,所有受试者家属对试验知情同意。
1.2 方法
1.2.1 血标本收集及酶联免疫吸附试验(ELISA) 在静脉注射免疫球蛋白(IVIG)治疗前(病程10 d内)和治疗后第3天(且体温正常)分别肝素抗凝管留取KD患儿外周血标本2 ml,并立刻送检。800 rpm离心10 min分离上层血浆,双抗体夹心ELISA(Bender MedSystem公司试剂盒)测定前列腺素E2水平,具体按照试剂盒说明书步骤操作。
1.2.2 实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)(1)单核/巨噬细胞(MC)总RNA的提取与定量:乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA·Na2)抗凝管留取静脉血3 ml,聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(P=1.077)密度梯度离心法分离外周血单核细胞。免疫磁珠(美国Invitrogen公司,111.49 D)分离外周血CD14+MC。进一步分离总RNA(Ambion公司试剂盒,AM1912),紫外分光光度计测定RNA含量,-80℃冰箱保存。(2)RT-PCR:参照说明书步骤逆转录合成cDNA(立陶宛MBI公司试剂盒,K1632),取1 μl cDNA为模板,所需引物向上海英骏生物技术有限公司订购合成(引物序列及PCR参数见表1),PCR扩增30~40循环。(3)RT-PCR产物鉴定:取COX-1、COX-2、TNF-α、IL-6等及β-action扩增产物10 μl在2%琼脂糖凝胶中,90 V电泳30 min,回收纯化,送交invitrogen公司测序。测序结果与Genebank中目的基因mRNA序列比较,扩增产物与目的基因序列完全一致。(4)Real-Time PCR:使用罗氏LightCycler480Ⅱ荧光定量PCR仪(德国QIAGen公司SYBRGreen试剂盒,204143),采用Relative Quantification Software Ver1.0软件对数据进行分析。以待测基因/β-action的CT比值表示结果。
表1 RT-PCR、荧光实时定量PCR引物
1.3 统计学方法 应用SPSS13.0软件包进行数据处理,符合正态分布的计量资料以均数±标准差(±s)表示,方差齐性检验后用t检验比较两组之间的差异,以P<0.05表示差异有统计学意义。符合正态分布的两组数据的相关性使用Pearson相关分析。
2.1 IVIG治疗前后和对照组血浆PGE2水平 KD急性期患儿IVIG治疗前血浆PGE2水平显著高于对照组[(18.48±3.57)pg/ml vs(6.90±1.77)pg/ml,t=11.89,P=0.000];IVIG治疗后下降[(9.74±2.71)pg/ml vs(18.48±3.57)pg/ml,t=12.73,P=0.000],见图1。KD-有冠状动脉病变组患儿血浆PGE2水平高于KD-无冠状动脉病变组[(19.95±3.74)pg/ml vs (17.50±3.17)pg/ml,t=2.09,P=0.045],见图2。
2.2 KD患儿治疗前后外周血MC COX-1、COX-2、IL-6、TNF-α水平 KD患儿IVIG治疗前COX-1、COX-2、TNF-α、IL-6水平均较对照组儿童上升,IVIG治疗后COX-1、COX-2、TNF-α、IL-6水平均较治疗前降低,差异均有统计学意义(P<0.05),见表2。KD患儿中的冠状动脉病变组COX-2水平高于无冠状动脉病变组,差异有统计学意义(P<0.05),而两组TNF-α、IL-6、COX-1水平比较差异均无统计学意义(P>0.05),见表3。
2.3 IVIG治疗前血浆PGE2水平和COX-2、TNF-α水平的相关性 KD急性期患儿IVIG治疗前PGE2水平和CD14+MC的COX-2、TNF-α水平均较正常对照组升高,血浆PGE2水平与COX-2、TNF-α水平均呈正相关(r=0.652,P=0.000;r=0.648,P=0.000),见图3。
图1 KD患儿IVIG治疗前后和对照组血浆PGE2水平(±s)
图2 KD有冠脉病变和无冠脉病变组患儿血浆PGE2水平(±s)
表2 KD组IVIG治疗前后和对照组样本基因表达相对定量比较(±s)
表2 KD组IVIG治疗前后和对照组样本基因表达相对定量比较(±s)
注:均采用荧光定量PCR检测,结果以待测基因/β-action的比值表示。aKD组IVIG治疗前后比较,P<0.05;bKDIVIG前与对照组比较,P<0.05;cKDIVIG后与对照组比较,P<0.05。
组别KDIVIG前组KDIVIG后组对照组COX-1(×10-4) 23.82±6.90ab13.24±5.63 14.87±6.72 COX-2(×10-2) 25.09±11.31ab14.20±5.54 11.67±4.50 IL-6(×10-4) 46.65±25.04ab24.95±16.69c2.74±1.07 TNF-α(×10-3) 113.69±46.11ab76.74±27.15c5.87±2.42
表3 KD组IVIG治疗前样本基因表达相对定量比较(±s)
表3 KD组IVIG治疗前样本基因表达相对定量比较(±s)
组别KD-有冠状动脉病变组KD-无冠状动脉病变组t值P值COX-1(×10-4) 22.15±5.03 23.37±5.79 0.641 0.864 COX-2(×10-2) 28.00±14.56 22.29±8.67 1.458 0.015 IL-6(×10-4) 47.21±18.51 46.91±23.72 0.041 0.572 TNF-α(×10-3) 118.86±56.52 103.52±33.80 1.006 0.215
图3 KD组IVIG治疗前血浆PGE2水平和CD14+MC COX-2、TNF-α水平的关系
川崎病是一种急性自身免疫性血管炎综合征,以亚裔人发病率为高,常见于<5岁儿童[7]。本病为自限性疾病,多数预后良好,但部分患儿可引起全身多系统受累,最严重的就是冠状动脉损害,是儿童获得性心脏病常见的病因之一,甚至成年后遗留严重后遗症[8]。目前研究认为,感染导致T细胞、MC等免疫活性细胞异常活化并产生的一系列炎症细胞因子,可能在KD患儿的血管内皮损伤过程中发挥重要作用并干扰自身免疫耐受[9]。我们课题组前期的研究也证实了川崎病急性期外周血单核细胞大量分泌NF-κB,介导炎症细胞因子过度产生[10]。此外,近年来研究显示,氧化应激因素可能参与了KD患者血管内皮损伤的发生发展[11-13]。
PGE2是产花生四烯酸环氧化酶途径的代谢产物之一,主要由MC产生,是机体应激条件下参与免疫调节的重要介质。PGE2通过受体的相互协同及拮抗作用,参与机体内环境稳态的维持,如调控T细胞、引起血小板聚集。PGE2在炎症发展的不同阶段发挥不同的作用,可以在致炎和抗炎两个方向上参与整个调节过程[14-15]。研究数据显示,在早期炎症反应阶段,通过EP2受体,前列腺素E2在人冠状动脉内皮细胞诱导β1-整合素活化,发挥促炎作用[5]。炎症过程中PGE2通过与缓激肽、5-羟色胺、组胺等介质在炎症部位相互作用,引起血管尤其是冠状动脉扩张,增加血管通透性,并产生致热源引起发热,参与炎症急性期的血管反应。此外,氧化应激反应过程中也有PGE2的参与[16]。
本研究的结果显示,KD急性期患儿外周血中PGE2水平高于健康同龄对照组儿童(P<0.05),与CD14+MC中的炎症因子TNF-α水平正相关,而且急性期存在冠状动脉病变的KD患者较未发生冠状动脉病变的KD患儿血浆中PGE2水平升高(P<0.05),患儿在IVIG治疗后PGE2水平较治疗前下降(P<0.05),提示PGE2参与了KD的发病机制并发挥着促炎作用,KD患儿血管炎的发生可能和其有关。大剂量IVIG通过降低急性期KD患儿PGE2水平,减少了氧化应激所致的冠脉损伤[17]。
环氧化酶(COX)是合成PGE2的主要限速酶,分为环氧酶-1(COX-1)和环氧酶-2(COX-2)二种异构酶。COX-1在体内呈生理性表达,催化PGE2合成,临床上常在KD急性期广泛使用COX-1抑制剂阿司匹林对抗血小板聚集[18-19]。本组中KD患儿在IVIG治疗后COX-1水平明显下降,考虑可能与KD组患儿在IVIG治疗后已经使用了数天大剂量阿司匹林有关。COX-2是COX-1的异构体,存在于多种类型细胞中,通常在正常生理状态下没有活性,在病理状态或应激状态下受NF-κB等炎症介质诱导激活,参与炎症、肿瘤的发生发展[20-21]。本研究结果进一步证实在KD急性期患儿外周血MC的COX-2显著升高,有冠状动脉病变的KD患儿COX-2和PGE2均水平高于无冠状动脉病变患者,且PGE2水平和CD14+MC的COX-2水平呈正相关。
总之,通过本研究我们发现KD急性期血浆PGE2水平升高,可能参与了KD冠脉病变过程,而IVIG治疗可下调COX-2表达,从而降低PGE2水平,在KD治疗过程中发挥抗血管炎、抗氧化应激等作用。
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Changes and significance for prostaglandin E2level in plasma of patients with Kawasaki disease.
YANG Yan-lan, WU Yu-hui,HUANG Que-lan,LI Cheng-rong,WANG Guo-bing,MA Wei-ke.The Second Department of Medicine, Shenzhen Children's Hospital,Shenzhen 518026,Guangdong,CHINA
Objective To observe the prostaglandin E2(PGE2)level in plasma of patients with Kawasaki disease(KD)and discuss the clinical significance.MethodsThirty-five patients with KD which treated in our hospital from May 2013 to October 2014 were selected.The plasma concentrations of PGE2were analyzed by ELISA technique.Real-time quantitative PCR was used to evaluate the expression level of cyclooxygenases-1(COX-1),cyclooxygenases-2(COX-2),tumor necrosis factor-α(TNF-α),interleukin-6(IL-6)on CD14+monocyte/macrophage cells (MC)before and after intravenous immunoglobulin(IVIG).Fifteen healthy children were selected as the control group,with the above indicators measured.ResultsThe levels of PGE2,COX-1,COX-2,TNF-αand IL-6 in acute KD patients were significantly higher than those in the control group(P<0.05),and they were down-regulated after IVIG(P<0.05).The level of PGE2and COX-2 in KD patients with coronary artery lesion were significantly higher than those without coronary artery lesion(P<0.05),and there were no statistically significant difference in COX-1, TNF-αand IL-6 between the two groups(P>0.05).ConclusionProstaglandin E2level in plasma of patients with KD is up-regulated and may play an important role in inflammatory and immune response and oxidative stress.
Kawasaki disease;Prostaglandin E2;Cyclooxygenases-2
R442.8
A
1003—6350(2015)18—2675—04
10.3969/j.issn.1003-6350.2015.18.0973
2015-03-15)
2013年深圳市医疗卫生类科研项目(编号:201303057)
李成荣。E-mail:418027143@qq.com