膜芯片快速诊断HBV基因型和耐药性方法的建立*

唐曙明，李爱敏，陈海霞，杨自华

（深圳市人民医院，广东 深圳518020）

根据乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）全基因核甘酸序列异源性≥8%，或S基因区核甘酸序列异源性≥4.2%的标准，HBV可分为A～H 8个基因型[1]。不同HBV基因型具有不同的地理区域性分布特征，在我国流行的HBV基因型主要有B、C、D三种，北方地区以C型为主，约占81.6%，南方地区则以B、C型为主[2]。不同HBV基因型在致病性和病毒学特性上存在明显差异，C、D基因型较B基因型具有更强的致病能力，更容易导致活动性肝病和肝细胞癌[3]。随着拉米夫定（LAM）、阿德福韦酯（ADV）、恩替卡韦（ETV）、替比夫定（LdT）等核苷类抗HBV药物在临床的广泛应用，HBV耐药的问题日益突出，严重地影响了疾病的转归。因此，建立简便、快速、敏感、高通量的HBV基因分型和耐药性检测方法对HBV感染的诊断、治疗、预后判断和流行病学分析具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 HBV B、C、D基因型标准株；腺病毒ATCC VR-1079AS/RB（Adenovirus,ADV）、人乳头瘤病毒ATCC VR-2237（human papillomavirus，HPV）和单纯疱疹病毒ATCC VR-1544（herpes simplex virus，HSV）标准株由亚能生物科技有限公司提供，11种标准菌株（包括大肠埃希菌、肺炎链球菌、绿脓假单胞菌、肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌、痢疾杆菌、枯草芽孢杆菌、表皮葡萄球菌）从中国生物制品检定所购入，187例HBV DNA阳性患者（103～109copies/ml）血清样本来自本院2012年3月-2012年7月门诊和住院患者。

1.1.2 仪器与试剂 ABI 9700 PCR扩增仪购于美国ABI公司，电泳仪购于北京六一仪器厂，图像分析系统为BIO-RAD公司GEL DOC 2000，分子杂交箱购自韩国FINE PCR公司，HBV核酸定量检测及提取试剂盒购于上海科华公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 吸取100μl样本处理液A于0.5ml离心管中，再加入100μl待检血清，振荡混匀，13 000 r/min离心10min，弃上清。加入25μl DNA提取液，震荡数秒充分溶解沉淀，2 000 r/min离心30 s。100℃干浴10min，13000 r/min离心10min备用。11种标准菌株经传代培养后，提取DNA备用。

1.2.2 引物与探针设计 用DNAMAN软件对GeneBank中HBV的序列数据进行多重比对，于HBV基因保守区设计11条特异性探针分别检测HBV-B、C、D和常见耐药突变(rtL180M、rtA181V、rtM204V/I、rtV207I、rtN236T)。另设1条通用探针作为内控点（内对照），以监测整个实验过程的有效性，探针序列见表1。

选择2对保守区片段为扩增引物，其中分型引物为：Prime5'：TCGTGTACAGGCGG，Prime3'：ACCAC TGAACAAAT，扩增片段长510 bp；耐药引物为：Prime5'：GAGTCTAGACTCGTGGTG，Prime3'：ATTGA TTGGAAAGT，扩增片段长742 bp。引物的5'用生物素进行标记，引物和探针由上海生工公司合成。

1.2.3 PCR扩增 在25μl反应体系中，dNTP混合物的终浓度为0.2 mmol/L，引物的终浓度均为0.4μmol/L，DNA模板20 ng，Taq DNA聚合酶2.5U。置于PCR仪上按下列条件扩增：50℃3min，93℃预变性6 min，然后按93℃30 s→58℃40 s→72℃45 s扩增，10个循环；93℃30 s→56℃40 s→72℃45 s扩增，10个循环；93℃30 s→55℃40 s→72℃45 s扩增，25个循环，最后72℃延伸7min。取5μl PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。

1.2.4 膜芯片制备 尼龙膜浸入5% EDAC 20 min，纯水洗膜，晾干。探针稀释液（5μm/L）点样于膜条上，晾干后，浸于0.1mol/L NaOH作用3min，纯水洗膜，晾干，室温储藏备用。

1.2.5 杂交与显色 将制备好的膜条编号后放入15ml杂交管中，加入扩增产物和6ml杂交缓冲液（2×SSC、0.1%SDS）置于沸水浴10min，放入已预热的杂交箱中，57℃杂交1.5 h。取出膜条，移至装有洗液（0.5×SSC、0.1%SDS）并已预热至57℃的50ml管中，于57℃轻摇洗涤15min。取出膜条，按杂交缓冲液：POD=2 000∶1配制孵育液，室温轻摇孵育30 min，弃去孵育液。用杂交缓冲液室温轻摇洗2次，每次5min。用柠檬酸缓冲液（0.1mol/L）室温洗膜2 min，同时配制显色液（19m l0.1mol/L柠檬酸钠、1 ml 2mg/ml TMB、10μl 3%过氧化氢H2O2），将膜条浸泡于显色液中避光显色10～15min观察结果。

1.2.6 结果判读 膜条在内控点（CC）位置应出现蓝色斑点，提示本次杂交、显色正常工作；其他出现的蓝色斑点表示为相应的HBV基因型和耐药突变类型。

表1 HBV基因分型与耐药突变探针列表

1.2.7 最低检出限确定 从187例临床HBV阳性分离株中随机抽取38例样本和HBV-B、C、D基因型标准株同步用上海科华HBV核酸定量试剂盒定量，然后进行系列稀释，分别制成104、103和102copies/ml浓度稀释液，按1.2.1～1.2.5步骤检测，以确定新建方法的最低检出限。

1.2.8 测序分析 对1.2.7所述38例临床样本和HBV-B、C、D基因型标准株送上海英骏生物技术有限公司进行测序分析，以检验PCR扩增的特异性和膜杂交结果的准确性。

1.2.9 临床样本检测 用新建方法对187例临床样本进行检测，分析深圳地区HBV基因型与耐药突变分布情况。

2 结果

2.1 PCR产物电泳结果

如图1所示，对HBV标准株和187例临床样本PCR 扩增产物进行电泳，在500 bp和750 bp处可见明显阳性条带，与预期片段大小一致。

图1 部分PCR产物电泳图

2.2 膜芯片杂交结果

膜条上的探针共两行，探针位置如表2所示，其中CC为内对照，其余位置分别对应相应探针。由图2可见，所有杂交膜条在CC位置均出现蓝色斑点，其余杂交斑点显色清晰，提示本次杂交显色正常。

表2 膜条探针位置示意表

图2 部分HBV临床样本与标准株反向斑点杂交结果图

2.3 DNA测序结果

对38例临床样本和HBV-B、C、D基因型标准株进行测序分析，其结果与膜芯片结果完全一致（图3）。

2.4 特异性与最低检出限确定

将ADV、HPV、HSV标准株和11种标准菌株用新建方法检测，结果在膜芯片上未出现阳性反应斑点。HBV-B、C、D标准株和38例临床株分别制成104、103和102copies/ml浓度进行检测，发现各株浓度在103copies/ml时检测结果仍为阳性，当菌液稀释至102copies/ml时，有8例阳性显色已经明显变弱，10例临床株未见阳性显色。

2.5 临床样本检测结果

在187例HBV阳性临床样本中检出B型108例，占57.8%；C型70例，占37.4%；B+C混合型8例，占4.3%；另有1例不能分型，未测出D型。在187例临床样本中共检出耐药突变49例，占26.2%。在49例耐药突变中，20例为rtL180M+rtM204V，占40.8%；13例为rtL180M+rtM204I，占26.5%；8例为rtM204I，占16.3%；4例为rtA181V，占8.2%；2例为rtN236T，占4.1%，1例 为rtA181V+rtN236T，占2.0%；1例为rtV207I，占2.0%。在49例耐药突变中，有32例为HBV-C，占65.3%；17例为HBV-B，占34.7%。

图3 部分HBV临床样本与标准株扩增产物测序结果图

3 讨论

HBV为一不完全环状双链DNA分子，基因组长约3 200 bp，含前-S/S区、前-C/C区、P区和X区共4个主要的开放读码框（ORF）。HBV复制的显著特征是存在一个有逆转录酶参与的、以mRNA为中间体的DNA-RNA-DNA过程。由于HBV逆转录酶缺乏严格的校正机制，故在HBV复制过程中核苷酸错配率高，基因突变频繁发生[4]。研究显示，S区基因序列既含相对稳定的序列保守区，又含相对多态的序列变异区，适用于HBV基因分型[5]，而所有核苷（酸）类似物耐药突变位点都位于HBV DNA聚合酶基因区（逆转录酶区），故耐药性检测探针多依据此区序列设计。本研究根据HBV S区基因多重比对结果，于保守区设计1条通用探针作为内对照，另设3条特异性探针分别检测HBV基因型B～D。根据HBV逆转录酶区基因多重比对结果，设计了rt180L、rt180M、rt204M、rt204V、rt204I、rt181A、rt181V、rt207M、rt207V、rt207I、rt236N和rt236T 5个位点共12条探针，基本上涵盖了4种抗HBV核苷（酸）类似物的常见耐药突变。实验中，通过多重PCR扩增，电泳出现预期条带，表明扩增成功。将HBV-B、C、D标准株和38例HBV临床样本的PCR产物与膜条杂交，结果在内控制（CC）位置均有明显杂交信号，表明杂交成功，扩增片段为目的基因片段。在膜芯片相应探针位置出现的阳性显色背景清晰，无交叉反应和其他非特异性反应。将ADV、HPV、HSV和11种标准菌株基因组DNA扩增后杂交，结果均为阴性，其特异性达到了100%。为进一步验证膜芯片对HBV分型和耐药检测的准确性,本研究将HBV-B、C、D标准株和38例临床样本的PCR产物进行测序，并将杂交结果与测序结果进行比较，结果显示，膜芯片结果与测序结果完全一致，准确性达到100%。为确定方法的检测灵敏度，本研究将HBV-B、C、D标准株和38例临床样本用实时定量PCR进行载量确认后，分别制成104、103和102copies/ml浓度进行检测，发现最低检出限达103copies/ml，表明该方法具有较高的检测灵敏度，从而肯定了其在分型和耐药性检测中的应用价值。

目前国际上已统一了HBV耐药位点的定位命名，即从逆转录酶区的上游第一个氨基酸起，分别为rtl～rt344[6]。研究表明，拉米夫定（LAM）最常见的耐药突变为rtM 204I/V±rtL180M，其中rtM204V多与rtL180M联合出现，rtM204I可单独出现，其1～5年累积耐药发生率分别为24%、38%、49%、67%与70%[7]。阿德福韦酯（ADV） 常见的耐药突变为rtN236T与rtA181V/T变异，两个位点变异可单独或联合出现，其1～5年累积耐药发生率分别为0%、3%、11%、18%与29%[8]。恩替卡韦（ETV）常见的耐药突变是在rtM204V+rtL180M变异基础上，再联合aT184、rtS202或aM250三个位点中至少一个位点突变，其1～5年累积耐药发生率分别为0.2%、0.5%、1.2%、1.2%与1.2%[9]。替比夫定（LdT）常见的耐药突变为rtM204I，其1～2年累积耐药发生率分别为4%与22%[10]。

在对187例HBV阳性临床样本检测结果中，检出B型108例，占57.8%；C型70例，占37.4%；B+C混合型8例，占4.3%；未测出D型；另有1例不能分型，分析可能为HBV-B、C、D之外的其他基因型。187例HBV阳性临床样本共检出耐药突变49例，占26.2%。在49例耐药突变中，20例为rtL180M+rtM204V，占40.8%；13例为rtL180M+rtM204I，占26.5%；8例为rtM204I，占16.3%；4例为rtA181V，占8.2%；2例为rtN236T，占4.1%，1例为rtA181V+rtN236T，占2.0%；1例为rtV207I，占2.0%。在49例耐药突变中，有32例为HBV-C，占65.3%；17例为HBV-B，占34.7%。上述结果与以往的研究基本相符[11-12]。

目前常用于HBV基因型与耐药突变的分子检测方法一般都基于PCR、核酸分子杂交、限制性片段长度多态性（RFLP）分析和DNA测序等原理，在已报道的方法中，或因操作步骤复杂、检测位点单一而不适应现代大规模检测与流行病学调查的要求，或因价格昂贵而难以在临床推广应用。本研究以多重PCR和反向线性杂交为基础，建立了膜芯片方法来同步检测HBV的基因型和耐药性。实验结果证实，本方法简便、快捷，具有较强的特异性和较高的敏感性，可大大降低临床HBV基因分型和耐药性检测的成本、缩短检测周期，为研究HBV的流行病学规律、快速制订最佳治疗方案、降低耐药毒株在人群中的播散从而最终控制HBV提供了新的技术平台，适合在临床推广使用。

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