miR-146a与类风湿关节炎患者疾病活动度的相关性研究

王楷文，邵 军，刘 磊

(昆山市第一人民医院中心实验室1、超声科2、风湿免疫科3，江苏 昆山 215300)

miR-146a与类风湿关节炎患者疾病活动度的相关性研究

王楷文1，邵 军2，刘 磊3

(昆山市第一人民医院中心实验室1、超声科2、风湿免疫科3，江苏 昆山 215300)

目的 通过检测类风湿关节炎(RA)患者血浆中miR-146a的表达，探讨miR-146a与疾病活动度的相关性。方法RA患者40例，其中活动期20例，非活动期20例，留取血浆提取和纯化miRNA，实时定量聚合酶链反应(PCR)检测miR-146a的表达，采用SPSS13.0软件进行统计学分析。结果活动期患者血液中炎性指标类风湿因子（RF)、C反应蛋白(CRP)、血沉（ESR)明显增高；受累指关节滑膜增生厚度、miR-146a的表达明显高于非活动期患者，差异有统计学意义(P＜0.05)；而两组患者的抗CCP抗体、受累指关节滑膜血流分级与滑膜动脉阻力指数(RI)比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。在RA活动期患者体内，miR-146a与滑膜增生厚度、血流分级、RF均有明显的正相关(P＜0.05)；而与血液中其他一些炎症指标(ESR、CRP、抗CCP)均无相关性(P＞0.05)。而非活动期患者的miR-146a与各项炎症指数均无关联(P＞0.05)。结论miR-146a在RA活动期患者血浆中高表达，且与反映RA患者病情活动度的一些特异性指标相关，而与其他一些非特异性指标无相关，提示血浆miR-146a可以作为RA患者疾病活动度的一个较特异性的预测指标。

类风湿关节炎；miRNA；疾病活动度

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种最为常见的系统性自身免疫性疾病，主要是以慢性关节滑膜炎症为特征，发病关节腔内充斥着淋巴细胞和巨噬细胞，其病理特征是关节滑膜及周围结缔组织异常增生，继而滑膜内大量新生血管增生和广泛慢性炎症性细胞浸润。滑膜组织表现为增生过度和凋亡受阻，其产生的基质金属蛋白酶破坏关节囊内软骨和骨，同时成纤维细胞增生促进关节纤维化。类风湿性关节炎在发病两年内即可出现不可逆性骨关节破坏[1-3]。miRNA作为一种调控RNA，在维持正常的细胞周期、分化、凋亡、代谢等方面发挥着作用[4]。越来越多的证据[5]表明，miRNAs在维持免疫功能、稳定免疫系统等方面发挥着重要作用。表达异常的miRNAs可能与慢性炎症、肿瘤及自身免疫性疾病等密切相关[6]。随着高频超声技术的不断发展，在早期诊断、评价类风湿关节炎的病程发展、判定病情活动度以及治疗效果等方面都有重要的意义[7]。本研究旨在检测RA患者血浆中miR-146a的表达，结合影像学、检验学诊断结果，分析其与RA患者病情活动度的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2012年7月至2013年7月在我院门诊诊治的类风湿关节炎累及手部小关节的患者40例为研究对象，其中女性32例，男性8例，年龄32～67岁，平均(49.5±17.5)岁，病程8个月至25年，平均12.4年。所有患者均符合1987年美国风湿病学会(ACR)修订的RA诊断标准和分类标准。其中活动期患者20例，RA活动性评分系统(DAS28)≥4.0，血沉(ESR)(48±13)mm/h，C反应蛋白(CRP)(8.5±1.3)mg/dl，类风湿因子(RF)(517±37.5)IU/ml；非活动期患者20例，DSA28≤2.6，ESR(25±10)mm/h，CRP(2.2±1.9)mg/dl，RF(53.3±37.6)IU/ml。收集RA患者抗凝血5 ml，分离血浆1 ml。以上实验室资料均来源于本院检验科报告单。

1.2 超声仪器和检测方法 采用GE Vivid 7、Toshiba Aplio XG，高频线阵探头频率为5～12 MHz的彩色多普勒超声诊断仪。血供情况采用彩色多普勒血成像和能量图进行观察。患者取仰卧位，双手五指分开置于检测台，检测患者双手掌指关节(MCP1～5)的掌侧和背侧、近端指间关节(PIP1～5)外加尺侧和桡侧，每个侧面均做横切和纵切面的扫查。在垂直骨面最厚的地方测量滑膜组织的厚度。

1.3 指标判断 (1)滑膜厚度：滑膜厚度正常，＜2 mm；轻度增生，2～5 mm；中度增生，5～9 mm；重度增生，＞9 mm。(2)血流供应：滑膜内无血流信号为0级；有1到2处点状的血流信号为1级；有1条主血管，或者伴有2～3条小血管为2级；血流丰富，有4条以上，或者呈网状为3级。

1.4 miR-146a的提取 用miRNeasy Mini Kit (QIAGEN公司)分离总RNA，取500 μl血浆样本，加入700 μl QIAzol液，充分混匀后放置室温5 min，加入140 μl酚氯仿，混匀15 s后放置室温下2～3 min，离心15 min(12 000×g)，小心吸取上清液至新柱子管中，加入525 μl无水乙醇后混匀，离心30 s(12 000×g)。加入700 μl洗液，离心30 s(8 000×g)，后尽量将柱内液体甩干，后重复加入洗液500 μl洗涤两遍(8 000×g，15 s)，完毕后加入50 μl洗液(8 000×g，1 min)，收集总RNA，用紫外分光光度计测定RNA浓度，以备后续使用。

1.5 miR-146a的反转录 用TaqMan®micro RNA逆转录试剂盒对提取的总RNA中的miRNA反转录成cDNA。按说明书将miRNA 5 μl加入反应体系中，反转录的反应条件：16℃30 min，42℃30 min，85℃5 min。反转录后产物用于后续实验。

1.6 RT-PCR检测miR-146a 取1μlcDNA，用miScript SYBR Green PCR Kit和miScript microRNA PCR Assay进行实时定量PCR。PCR反应体系20 μl，含cDNA 2 μl，2×Quantitect SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，PCR引物(miR-146a或U6的上下游引物) 4 μl，RNase-free water 4 μl，反应条件：95℃15 min，1个循环；94℃15 s，55℃30 s，70℃30 s 40个循环。在PCR仪(美国ABI公司)上进行实时荧光定量PCR，计算各标本平均Ct值，以小分子RNA U6作为内参，将miR-146a155的ct值减去U6 Ct值作为δCt值。计算标准化后的2-δCt值表示miRNA的相对表达含量。

1.7 统计学方法 采用SPSS13.0软件包进行数据统计分析，计量数据以均数±标准差(±s)表示。RA患者活动期与非活动期两组均数比较用独立样本t检验；RA滑膜厚度、血流级数与miRNA表达量进行Pearson相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-146a在RA两组患者血浆中的表达 miR-146a在RA活动期患者血浆中的表达水平高于非活动期患者，差异有统计学意义(P＜0.05)，活动期患者血液中炎性指标(RF、CRP、ESR)明显高于非活动期患者，差异均有统计学意义(P＜0.05)，但抗CCP差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

表1 RA活动期与非活动期患者血浆中miR-146a的表达(±s)

表1 RA活动期与非活动期患者血浆中miR-146a的表达(±s)

活动期非活动期t值P值0.440±0.185 0.035±0.008 9.162 0.000 517±37.5 53.3±37.6 15.881 0.000 8.5±1.3 2.2±1.9 12.256 0.000 48±13 25±10 16.261 0.000 718±305.1 636.7±297.5-1.162 0.194

2.2 两组RA患者受累指关节炎症指数的变化 活动期患者滑膜增生厚度与非活动期患者比较明显增厚，差异具有统计学意义(P＜0.05)，而滑膜血流分级与滑膜动脉RI在两组患者中差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

2.3 miR-146a与RA患者指关节炎症指数的相关性分析 RA活动期患者的miR-146a与滑膜增生厚度、血流分级均显明显的正相关(P＜0.05)，与RF也呈现明显的正相关，而与血液中其他一些炎症指标(ESR、CRP、抗CCP)均无明显相关性(P＞0.05)。而在非活动期患者，miR-146a与各项炎症指数均无关联(P＜0.05)，见表3。

表2 活动期与非活动期RA患者指关节炎症指数变化(±s)

表2 活动期与非活动期RA患者指关节炎症指数变化(±s)

注：RI，阻力指数。

t值P值10.927 0.000 -2.689 0.349 -1.236 0.258

表3 活动期与非活动期RA患者miR-146a与指关节炎症指数相关性分析(±s)

表3 活动期与非活动期RA患者miR-146a与指关节炎症指数相关性分析(±s)

项目miR-146a(0.440±0.185)r值P值miR-146a(0.035±0.008)r值P值滑膜厚度3.45±0.58 0.539 0.000 2.61±0.28 0.298 0.359滑膜血流分级0.85±0.23 0.735 0.000 1.08±0.36 0.546 0.639滑膜动脉RI 0.53±0.12 0.457 0.603 0.66±0.25 0.423 0.591 RF(IU/ml) 517±37.5 0.758 0.000 53.3±37.6 0.175 0.679 CRP(mg/dl) 8.5±1.3 0.398 0.427 2.2±1.9 0.383 0.453 ESR(mm/h) 48±13 0.257 0.339 25±10 0.253 0.312抗CCP(Ru/dl) 718±305.1 0.023 0.970 636.7±297.5 0.035 0.800

3 讨论

miR-146家族主要包括miR-146a和miR-146b两个基因，两个基因分别位于人第5、10号染色体，两者的成熟序列仅相差2个碱基，这两个miRNA在有些细胞中功能相近，但miR-146a仅在Treg细胞中高度表达[8]。Groh等[6]研究发现miR-146a对于维持正常的细胞免疫调节功能发挥着至关重要的作用。miR-146a的缺失可致细胞中的免疫失衡，主要表现为IFN-γ介导的多器官损害。miR-146a的缺失直接导致其靶基因STAT-1表达增加，而STAT-1增加又可选择性清除IFN-γ受体下游基因SOCS1，从而导致细胞免疫功能异常。适当的miR-146a表达对于Th1细胞的反应及相关自身免疫性疾病起重要作用，其中，类风湿性关节炎作为一种典型的Th1细胞的反应及相关自身免疫性疾病，自然受到了众多miRNAs研究学者的关注。

Filiponicz等[9]研究发现，在类风湿关节炎患者和骨关节炎患者的滑膜成纤维细胞(RASFs)中，miRNA-146a在RA的表达水平显著高于对照组骨关节炎的患者。通过向体外RASFs培养基中添加一系列炎症因子(IL-1、LPS、TNF-α)模拟RA的炎性环境，结果显示，LPS和IL-1均可诱导miR-146a产生。由此椎断，miR-146a水平增高与疾病引发的炎症反应相伴随。Friedman等[10]研究发现，miRNA-146a在RA患者外周血单核细胞中的表达水平升高，达到对照组的1.8倍，TRAF6和IRAK-l的表达水平在实验组和对照组之间几乎无明显变化，作为miRNA-146a的两个重要的靶分子是TNF-α通路重要的信号分子，miRNA-146a对于TNF-α的调控表达至关重要。RA患者体内表达上调的miRNA-146a却不能抑制TRAF6和IRAK-l这两个靶分子的水平，由此推测，RA患者体内miRNA-146a功能缺陷是导致TNF-α在患者体内持续表达的重要原因，同时也证实miRNA-146a与疾病炎症的程度、疾病的活动性息息相关。

本研究结果显示miR-146a在RA活动期患者血浆中的表达水平明显高于非活动期，差异有统计学意义(P＜0.05)，与上述学者研究结果一致。研究表明，RA活动期患者受累关节超声下表现为一些低回声区，与滑膜囊积液之间有较为清楚的界限，为滑膜增生所致[11]，与本实验所得出的结论(RA活动期患者滑膜增生厚度明显高于非活动期患者)是一致的。血管内异常血流信号是RA的特征性改变，尤其在RA活动期，滑膜内新生血管过渡增生，血流灌注明显增多，而静止期RA患者血管内血流量明显减少[12]。RI值可反映舒张期血流，在RA中可作为一个病情严重的检测指标，活动期血管翳增多，RI值减少，反之亦然[12]。本实验中所得出的结论显示滑膜血流分级在两组患者之间差异无统计学意义(P＞0.05)，与目前公认结果不相符，考虑为一些活动期患者经过药物治疗后，滑膜组织进入休眠期或纤维化，滑膜内血流减少，但滑膜厚度尚未明显变薄。

本研究结果还显示RA活动期患者血浆中miR-146a的表达水平与滑膜增生厚度、滑膜血流分级呈现明显的正相关关系(P＜0.05)，与滑膜动脉RI却无相应的相关关系(P＞0.05)，可能是由于滑膜动脉RI值仅限于色多普勒显像中能显示出，活动期患者滑膜处于过度增生的状态，人为准确测出RI值困难，导致获值样本量过少，影响实验结果。本实验结果还显示：miR-146a与RA相对特异性因子RF呈现正相关关系(P＜0.05)，与RA特异性指标(抗CCP抗体)却无关联。抗CCP抗体是RA早期诊断的特异性指标，而RF可作为疾病损伤严重性的较好的标记物，此观点结合我们所收集的病例都已出现关节破坏的特征，可以解释miR-146a与RF有相关性这一结果。我们还证实：活动期RA患者miR-146a与血液中一些非特异性炎症相关因子(ESR、CRP)无相关关系，可能是由于活动期患者样本量过少所致，也可能患者的治疗药物对miR-146a的表达影响较小，导致三者变化不一致。上述所有指标在非活动期患者体内均无得到与miR-146a明显相关证据(P＞0.05)，说明miR-146a在RA稳定期缺乏较高的临床价值。

综上所述，血浆miR-146a不仅可以作为相对特异诊断RA的生物标志物、还可以作为RA病情活动度的预测指标，为RA的疗效观察及预后评估提供重要的依据。本实验有待于进一步完善实验数据，研究分析血浆miR-146a与其他受累关节(膝关节、腕关节等)病情活动度的关系，以更进一步确定其在RA中的价值。

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Correlation analysis between miR-146a and disease activity degree in patients with rheumatoid arthritis.

WANG Kai-wen1,SHAO Jun2,LIU Lei3.Central Laboratory1,Department of Ultrasonography2,Department of Rheumatology3,the First People's Hospital of Kunshan,Kunshan 215300,Jiangsu,CHINA

Objective To explore the expression of miR-146a in patients with rheumatoid arthritis(RA),and to analyze the correlation between miR-146a and disease activity degree.MethodsPlasma were separated from the peripheral blood of 40 RA patients(20 of active stage and 20 of inactive stage).Total RNAs were isolated and microRNA(miRNAs)were purified.The levels of miR-146a were determined by quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR).Statistical data were analyzed using SPSS13.0 Software.ResultsThe blood inflammatory markers,including rheumatoid factor(RF),C reactive protein(CRP),erythrocyte sedimentation rate(ESR)in patients of active stage were increased significantly.The synovial hyperplasia,the miR-146a expression level in patients of active stage were significantly higher than those of inactive stage(P＜0.05).There was no significant difference between the two groups in anti-CCP antibody,synovial blood flow grading and synovial artery RI(P＞0.05).There was significantly positive correlation between miR-146a and synovial hyperplasia thickness,grade of blood flow,RF in active RA patients(P＜0.05), but there was no significant correlation between miR-146a and other inflammatory markers(ESR,CRP,anti CCP) in the blood(P＞0.05).In inactive patients,miR-146a showed no association with inflammatory indexes(P＞0.05).ConclusionmiR-146a shows high expression in active RA plasma,and is associated with specific indicators of disease activity degree,which can be used as a predictor of disease activity degree of RApatients.

Aheumatoid arthritis(RA);microRNA(miRNA);Disease activity degree

R593.22

A

1003—6350（2015）08—1167—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.08.0417

2014-09-22)

刘 磊。E-mail：kw.wang2008@gmail.com