趋化因子CXCL10启动子区-201G/A多态性与慢性乙型肝炎易感相关性研究

李晓阳，张 强，易显富，袁 情，唐文娟

(1.长沙泰和医院检验科，湖南 长沙 410000；2.中南大学湘雅三医院呼吸科，湖南 长沙 410000；3.湖北医药学院附属太和医院急诊科，湖北 十堰 442000；4.广州中医药大学第一附属医院检验科，广东 广州 510405；5十堰市妇幼保健院妇女保健科，湖北 十堰 442000)

趋化因子CXCL10启动子区-201G/A多态性与慢性乙型肝炎易感相关性研究

李晓阳1，张 强2，易显富3，袁 情4，唐文娟5

(1.长沙泰和医院检验科，湖南 长沙 410000；2.中南大学湘雅三医院呼吸科，湖南 长沙 410000；3.湖北医药学院附属太和医院急诊科，湖北 十堰 442000；4.广州中医药大学第一附属医院检验科，广东 广州 510405；5十堰市妇幼保健院妇女保健科，湖北 十堰 442000)

目的 研究趋化因子CXCL10启动子区-201G/A位点单核苷酸多态性(SNP)与汉族人群慢性乙型肝炎(CHB)的易感相关性。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法对142例慢性乙型肝炎患者(CHB组)和150名健康者(HC组)的CXCL10启动子区-201G/A SNP进行基因分型，以血清丙氨酸氨基转氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(T-Bil)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)、白蛋白(ALB)、乙型肝炎E抗原(HBeAg)、乙型肝炎病毒(HBV-DNA)及其病毒载量、乙肝病毒大蛋白(HBV-LP)、乙型肝炎病毒前s1抗原(HBV-PreS1)作为检测指标。结果与HC组比较，CHB组的CXCL10-201位点GA＆AA基因型及A等位基因分布频率显著增加，组间差异具有统计学意义(P＜0.05)，且等位基因A可增加CHB易感风险(OR=1.940，OR95%CI：1.139～3.305)。CXCL10-201G/A多态性与ALT、AST、HBeAg、HBV-DNA、HBV-LP、HBV-PreS1阳性率无相关性(P＞0.05)；CHB组病毒载量在105～106取值范围时，等位基因A与G分布频率差异具有统计学意义(χ2=3.958，P=0.047)。结论CXCL10启动子区-201G/A位点多态性与CHB患病风险有关联，且等位基因A可能是HBV易感基因。

CXCL10；-201G/A；多态性；慢性乙型肝炎；易感性

慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B，CHB)是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染引起，遗传、机体免疫和环境综合作用导致的慢性传染性疾病。趋化因子γ干扰素诱导蛋白10(CXCL10/IP-10)是趋化性细胞因子，可介导乙型肝炎过程中病毒清除与炎症反应，在CHB的发生、发展和HBV感染相关肝脏疾病进程中起着重要作用[1-2]。CXCL10亦可强化肝细胞表面选择素和整合素的表达，与细胞穿透血管定向迁移到炎症部位以致肝细胞损伤密切相关[3-4]。研究表明趋化因子CXCL10基因存在多个SNP位点，包括rs56061981、rsl2979860、rsl2980275、rs8099917和rs1439490等，从而在功能上可改变核蛋白的亲和力，影响CXCL10转录水平和表达[4-5]，进而改变个体对HBV的易感性及CHB进程，且有研究发现CXCL10启动子区-201G/A多态性与病毒性肝炎等免疫性疾病可能存在关联性[6-7]。本研究通过比较CXCL10启动子区-201G/A基因型及其等位基因在正常人、CHB患者中的分布频率差异，探讨CXCL10-201G/A多态性与CHB易感相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 142例汉族病例组成员均为2010年5月至2012年11月门诊与住院的CHB患者(CHB组)，均符合《2010年慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准。病例入选标准：①年龄20～70岁；②HbsAg阳性至少在6个月以上；③血清谷丙转氨酶反复升高；④均接受过肝组织活检，且病理性检测均符合CHB。同时排除下列情况：前6个月接受过系统的抗病毒药物治疗；失代偿期肝病重叠其他感染性疾病、酒精性肝病、脂肪肝和药物性肝病等；合并精神病、自身免疫性肝炎、糖尿病、甲状腺功能亢进、溶血性贫血；妊娠哺乳妇女或进行过器官移植；家族有精神病史，酗酒吸毒史。另选150例体检正常的志愿者(汉族)为健康对照组(HC组)，无心脑血管病史和肝肾血液病自身免疫性疾病，经检测排除感染性疾病。本研究经医院伦理学委员会批准，患者签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 清晨空腹真空采集HBV感染者肘静脉血3管(K2EDTA抗凝管)，每管2 ml，其中一管在4℃保存，并在室温下4 h内完成肝功能检测。第2管在4 h内离心(3 000 r/m，5 min)，分离并分装血浆冻于-70℃低温冰箱，以备检测血浆HBV-DNA用；第3管用于分离提取外周血淋巴细胞以备提取基因组DNA。同时由专人用统一调查表记录一般的人口学和流行病学资料。

1.2.2 患者基因组DNA提取 参照已建立的方法[8]。取EDTA-K2抗凝的全血200 μl与浓度6 mol/L碘化钠(NaI)1:1混匀，加氯仿/异戊醇(24:1)400 μl，混匀，在15 000 r/min条件下离心15 min，吸取上清液400 μl，加入240 μl纯异丙醇混匀，室温静置15 min，再在15 000 r/min条件下离心1 min，小心弃去上清液，沉淀物用70%乙醇洗涤3次，室温干燥，加TE (Tris/EDTA)缓冲液50 μl溶解DNA，-20℃备用。

1.2.3 TNF-α启动子区-863C/A基因型检测①引物设计参照文献[6]，由生工生物工程(上海)有限公司合成。上游引物：5'-GCA GAT ACT GTC TCA GAA CCT GGT A-3'；下游引物：5'-TGT CAC CAT CTC TCA TTT TGA TTG T-3'。②PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳：PCR反应总体系为25 μl，扩增循环参数：94℃先预变性5 min，然后按94℃40 s、58℃40 s和72℃90 s，共40个循环，最后72℃延长到5 min。PCR结束后再取10 μl进行2%琼脂糖凝胶电泳(5 V/cm，电泳40 min)，在紫外灯下观察PC R扩增效率。③PCR产物鉴定分型-酶切+琼脂糖凝胶电泳：酶切产物与10×loading buffer(3 μl)混匀，于琼脂糖凝胶(3%)中电泳鉴定。以D2000作为DNA标记物，在1×TAE buffer中电泳30 min(恒压140 V)。在紫外线下观察和照相并记录。④选取部分标本的PCR产物送上海英俊生物技术有限公司，使用ABI 3730测序仪测序，得到测序图，以验证PCR-FLP的结果。

1.2.4 观察指标及检测方法 肝功能指标定量检测采用日立全自动生化分析仪及其配套试剂检测，具体步骤严格按试剂盒说明书操作。阳性标准: ALT＞40 U/L；AST＞40 U/L。HbeAg检测采用化学发光定量法，在美国Abbott公司ARCHITECT i2000SR全自动分析仪上进行，采用仪器配套试剂，按照Abbott化学发光免疫分析仪标准操作规程进行检测，阳性标准：HbeAg＞1.0 S/CO。HBV-DNA定量采用ABI 7500基因扩增仪、以实时荧光定量PCR法检测(试剂由上海科华生物技术公司提供)，PCR反应条件及步骤按试剂说明书要求设置操作，应用ABI 7500配套软件分析HBV DNA载量。HBV DNA阴转标准：＜103copies/ml。HBV-LP、Pre-S1抗原采用ELISA双抗体夹心法检测，严格按照试剂盒操作说明书进行操作，选择波长450 nm，通过酶标仪测定吸光度(A)值，按要求设定Cutoff值，测定结果大于Cutoff值为阳性。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0软件包进行统计学分析，计量资料以均数±标准差(x-±s)表示，组间比较采用t检验，相关分析采用Spearman秩相关检验；计数资料采用χ2检验，以哈迪温伯格(Hardy-Weinberg)遗传平衡定律检验确认研究样本的群体代表性，以OR及其OR95%CI表示患病风险；检验水准α= 0.05，双侧，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CXCL10-201G/A位点基因型和等位基因频率分布 CHB组和HC组比较，性别、年龄、家族史、酗酒史和吸烟史等差异亦无统计学意义(P＞0.05)，且T-Bil、GGT和ALB差异亦无统计学意义(P＞0.05)，提示两组均衡可比。但ALT和AST组间差异有统计学意义(P＜0.01)，见表1。经哈迪-温伯格遗传平衡定律检验，趋化因子CXCL10启动子区-201G/A位点的基因型均符合分布(P＞0.05)，提示研究人群具有良好群体代表性(见表2)。-201G/A位点共有3种基因型，分别是GG、GA和AA，且以GG和GA多见(在CHB和HC组中分别占97.2%和99.3%)。CHB组与HC组基因型(GA+AA)：GG比值分别约为1:2.84和1:5.52,差异具有统计学意义(χ2= 5.138，P=0.023)，等位基因A：G比值分别约为1:5.88和1:11.50，差异具有统计学意义(χ2=6.111，P=0.013)。HC组与CHB组比较，GA＆AA基因型与CHB存在统计学关联(OR=1.946，OR95%CI为1.088～3.479)，等位基因A可能是CHB的危险因素(OR=1.940，OR95%CI为1.139～3.305)。

表1 两组人口基本情况及相关指标基线水平的比较(±s)

表1 两组人口基本情况及相关指标基线水平的比较(±s)

注：丙氨酸氨基转氨酶(ALT)，天冬氨酸氨基转移酶(AST)，总胆红素(T-Bil)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)，白蛋白(ALB)。

组别 性别(例)男女年龄(岁) ALT (U/L) AST (U/L) T-Bil (μmol/L) GGT (U/L) ALB (μmol/L)乙肝家族史(例)是否酗酒(例)是否吸烟(例)有无无有 无CHB组HC组检验值P值99 100 43 50 χ2=0.313 0.576 41.62±12.97 38.24±14.05t=0.622 0.535 72.71±16.64 31.07±10.25t=37.062 0.000 65.82±9.56 29.06±7.43t=54.449 0.000 17.16±3.24 14.97±2.76t=1.091 0.276 31.30±8.36 32.45±6.52t=0.835 0.404 50.14±14.73 47.73±12.26t=1.316 0.189有21 14 49 43 χ2=2.058 0.151 121 136 64 73 78 77 93 107 χ2=0.379 0.538 χ2=1.153 0.283

表2 趋化因子CXCL10启动子区-201G/A基因型分布频率的比较[例(%)]

2.2 CXCL10-201G/A多态性与AST、ALT、HbeAg的相关性 -201G/A的等位基因A与G相比，ALT和AST的阳性率差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表3，OR及OR95%CI为1.174(0.604～2.281)和1.268(0.653～2.461)，提示A等位基因可能与CHB患者ALT和AST阳性表达不相关；CHB组携带等位基因G和A的HbeAg阳性率分别为68.7%和80.5%，差异无统计学意义(P＞0.05)，提示等位基因A可能不是HbeAg阳性表达的危险因素(OR=1.877，OR95%CI：0.828～4.256)。

表3 多态性与AST、ALT、HbeAg的相关性

2.3 CXCL10-201G/A多态性与HBV-DNA、HBV-LP、HBV-PreS1的相关性 -201G/A的等位基因A与G相比，HBV-LP、HBV-PreS1及HBV-DNA的表达降低，但差异无统计学意义(P＜0.05)，见表4。同时等位基因A与HBV-LP、HBV-PreS1的表达不相关(OR95%CI分别为0.489～1.974、0.485～1.829和0.575～2.447)，表明等位基因A可能不会是CHB的保护因素。-201G/A位点等位基因与HBV-DNA病毒载量相关性分析结果显示：HBV-DNA病毒载量在105～106范围时，等位基因A与等位基因G差异具有显著统计学意义(P= 0.047)，见表5，表明等位基因A可能与HBV-DNA病毒载量相关，提示等位基因A可能是CHB的危险因素。

表4 CXCL10-201G/A多态性与HBV-DNA、HBV-LP、HBV-PreS1的相关性

表5 CXCL10-201G/A等位基因与HBV-DNA病毒载量的相关性

3 讨论

HBV感染可诱导已感染的肝细胞和血管内皮细胞内高表达趋化性CXCL10，CXCL10过度聚集可导致已表达CXCR3的T细胞迁移到受感染的肝细胞，因此CXCL10在病毒性肝炎的发展和转归及肝脏的免疫损伤中起重要作用[9-10]。有研究证实呈CXCL10的高表达和相应的受体相互作用可趋化白细胞向炎症和感染部位迁移，影响正常生理条件下淋巴细胞的归巢，也拮抗病理状态下炎症部位对淋巴细胞的募集[11]。位于CXCL10启动子区域的201位点被认为具有SNP，γ干扰素刺激外周血单个核细胞时，拥有AA和GA基因型的患者更易发生CXCL10高转录[6，9]。有研究发现CXCL10启动子区-201G/A位点SNP与CHB易感性有相关性，且-201G/A位点SNP可改变机体对HBV的易感性及疾病进展过程[6，9-10]。本研究结果显示我国汉族人群趋化因子CXCL10启动子区201位点基因型以(GG+GA)为主，等位基因频率G＞A，与相关研究结果报道一致[6，9]。同时，本研究证实-201G/A位点SNP与CHB易感性关联，A等位基因与HBV感染的慢性化相关。

CHB患者的血清和肝组织中CXCL10水平均增高，且与血清HbeAg、ALT水平等相关[12]。血清AST/ ALT比值可判断肝病的严重程度和预后[13]。本研究结果显示：CHB组ALT和AST阳性率在各基因型及等位基因间差异均无统计学意义(P＞0.05)，虽未发现等位基因A能提高CHB患者ALT和AST的阳性率，但由于ALT和AST的升高与病情程度有一定的关系，在轻度肝炎时仍有患者的ALT和AST在正常范围[14]，因此不能排除CXCL10启动子区-201G/A位点与CHB易感性有关联。HbeAg可判定HBV复制程度及CHB患者预后[15]。但是HbeAg的转阴并不能完全排除病毒的感染与复制的可能，本研究结果与此相符，等位基因A并不会使CHB患者HbeAg阳性率增加，且亦不能否认CXCL10启动子区-201G/A位点与CHB的相关性。

HBV-DNA含量是判断病毒复制活跃和具有传染性最为直接可靠的依据，定量HBV-DNA可反映HBV基因水平的复制状况[16]。有研究表明HBV-LP与HBV-PreS1可反映HBV蛋白水平的复制状况[17-18]。HBV-LP与病毒复制、病毒颗粒组装和从细胞内释放调节密切相关。PerS1-Ag是HBV感染标志和复制依据，可体现病毒复制和病毒颗粒存在[17]。本研究结果显示-201G/A位点与HBV-DNA、HBV-LP、HBV-PreS1阳性率的无相关性(P＞0.05)，且等位基因A可能不是CHB的保护因素。外周血HBV-DNA病毒载量水平提示病毒导致肝细胞损害、破坏，肝功能异常，肝纤维化进一步发展[19-20]。本研究结果显示当HBV-DNA病毒载量在105～106时，等位基因A与等位基因G组间差异有统计学意义(P=0.047)，携带有等位基因A的患病风险是携带有等位基因G的2.764倍，提示等位基因A可能与病毒HBV-DNA的复制相关，-201G/A多态性可能改变CHB患者体内病毒的复制状况。

综上所述，CXCL10启动子区-201G/A多态性与CHB存在遗传关联，且等位基因A可能是易感基因，但本研究在设计研究方案及结果分析未充分考虑遗传因素与环境因素之间的交互作用，且其作用机制尚不明确，今后仍需开展大样本量和不同种族独立的病例-对照研究和功能性研究去明确CXCL10启动子变异体对基因表达以致CHB发展和转归的影响。

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Investigation of the association between the SNP in-201 loci of chemotactic factor CXCL10 gene promoter region and the susceptibility to chronic hepatitis B.

LI Xiao-yang1,ZHANG Qiang2,YI Xian-fu3,YUAN Qing4,TANG Wen-juan5.1.Department of Clinical Laboratory,Taihe Hospital of Changsha City,Changsha 410000,Hunan,CHINA; 2.Department of Respiration,the Third Xiangya Hospital of Central South University,Changsha 410000,Hunan,CHINA; 3.Department of Emergency,the Affiliated Taihe Hospital of Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,Hubei, CHINA;4.Department of Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital of Guangzhou University,Shiyan 442000,Hubei,CHINA; 5.Women'sHealthDepartment,ShiyanMaternalandChildHealthHospital,Shiyan442000,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the association between the single nucleotide polymorphism(SNP) in-201 loci of chemotactic factor CXCL10 gene promoter region and the susceptibility to chronic hepatitis B(CHB).MethodsOne hundred and forty-two patients with chronic hepatitis B(CHB group)and 150 healthy controls(HC group)were included in our research.Genotypes of-201 loci in the chemotactic factor CXCL10 gene promoter were examined by the polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP).The serum levels of alanine aminotransferase(ALT),aspartate aminotransferase(AST),total bilirubin(T-Bil),gamma glutamyl transpeptidase(GGT),albumin(ALB),hepatitis B e antigen(HBeAg),hepatitis B virus(HBV-DNA)and the HBV-DNA viral load,hepatitis B virus large protein(HBV-LP)and hepatitis B virus S1 antigen(HBV-PreS1)were detected.ResultsCompared with HC group,the frequency distribution of the GA＆AA genotype of CXCL10-201A/G was significantly increased in CHB group(P＜0.05),as well as the frequency distribution of the A-allele.Moreover, the A-allele of-201 loci may be associated with the susceptibility to CHB virus(OR=1.940,OR95%CI:1.139～3.305). CXCL10-201A/G SNP was not associated with the positive rate of ALT,AST,HbeAg,HBV-DNA,HBV-LP, HBV-PreS1(P＞0.05).When HBV-DNA viral load in the CHB group was in the range of 105～106 copies/ml,the frequency distribution of A-allele and G-allele was statistically significant(χ2=3.958,P=0.047).ConclusionSNPin-201 loci of CXCL10 gene promoter region is associated with susceptibility to chronic hepatitis B,and A-allele may be the susceptible factors of HBV infection.

CXCL10;-201G/A;Polymorphism;Chronic hepatitis B;Susceptibility

R512.6+2

A

1003—6350（2015）14—2093—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.14.0755

2015-01-22)

湖北省教育厅资助课题（编号：鄂教科Z20082401）

唐文娟。E-mail：wenjuantangfuyou@163.com