液相色谱－串联质谱法检测牛奶中苯并咪唑类药物

（北京市饲料监察所）

苯并咪唑类药物是一类含有2 个氮原子的杂环化合物，自20世纪80年代初问世以来，相继合成了许多广谱、高效、低毒的药物，其中主要的有甲苯咪唑、阿苯哒唑、噻苯咪唑、氟苯咪唑、芬苯哒唑等。它们的基本作用相似，主要对线虫具有较强的驱杀作用，有的不仅对成虫，而且对幼虫也有效。但这类药物具有致畸作用，对人类也可引起与动物同样的潜在危害。随着苯并咪唑类药物的广泛应用，其产生的毒副作用还会对人体产生直接的危害，因而苯并咪唑类药物在牛奶中的残留问题已经日益引起人们的关注。

1 检测过程

牛奶中的苯并咪唑类药物经乙酸乙酯提取，氮气吹干后用酸化乙醇复溶，正己烷脱脂；经MCX阳离子固相萃取小柱净化，氨化甲醇洗脱后氮气吹干，残余物加入20%甲醇+0.1%甲酸水溶液复溶，过0.22 μm滤膜后供液相色谱－串联质谱仪测定。

2 试剂和仪器设备

2.1 试剂

以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯试剂，水为符合GB/T 6682规定的一级水。

阿苯哒唑、阿苯哒唑砜、阿苯哒唑亚砜、胺基阿苯哒唑、噻苯咪唑、5-羟基噻苯咪唑、甲苯咪唑、胺基甲苯咪唑、羟基甲苯咪唑、芬苯哒唑、芬苯哒唑砜、奥芬哒唑、氟苯咪唑和2-胺基-氟苯咪唑等苯并咪唑类药物及其代谢物混合标准工作液（10 μg/mL），由中国兽医药品监察所提供；乙酸乙酯；氯化钠；乙醇；盐酸；正己烷；甲醇，色谱纯；乙腈，色谱纯；50%甲酸甲醇溶液，取甲酸50 mL加甲醇至100 mL，混匀即得；2%碳酸钠水溶液，称取碳酸钠2 g，用水溶解并稀释至100 mL，混匀即得；酸化乙醇溶液（乙醇+0.1 mol/L盐酸溶液，V/V＝2∶1），量取乙醇20 mL加入0.1 mol/L盐酸溶液10 mL，混匀即得；5%氨水甲醇溶液，取氨水5 mL加甲醇至100 mL，混匀即得；20%甲醇+0.1%甲酸水溶液，量取甲醇20 mL和甲酸0.1 mL，用水溶解并稀释至100 mL，混匀即得；0.1%甲酸乙腈溶液，取甲酸0.1 mL加乙腈至100 mL，混匀即得；0.1%甲酸水溶液，取甲酸0.1 mL加水至100 mL，混匀即得；0.1 mol/L盐酸溶液，取盐酸9 mL加水稀释至1 000 mL，混匀即得。

2.2 主要仪器与设备

液相色谱－串联质谱仪，Waters公司2695-Quattro micro，配电喷雾离子源；分析天平（感量0.01 g），AR3130；电子天平（感量0.0001 g），AX-105；固相萃取装置；氮吹仪；旋涡混合器；高速冷冻离心机，D-37520型；离心管，50 mL；玻璃试管，10 mL；MCX固相萃取柱，60 mg/3 cc；微孔滤头，0.22 µm。

2.3 线性试验

2.3.1 标准溶液的配制

（1）苯并咪唑类药物及其代谢物标准储备液（1 mg/mL）

准确称取适量的5-羟基噻苯咪唑、噻苯咪唑、胺基阿苯哒唑砜、阿苯哒唑亚砜、阿苯哒唑砜、奥芬哒唑、羟基甲苯咪唑、胺基甲苯咪唑、2-胺基-氟苯咪唑、芬苯哒唑砜、甲苯咪唑、阿苯哒唑、氟苯咪唑、芬苯哒唑对照品，用50%的甲酸甲醇溶液分别配制成1 mg/mL的标准储备液。配制完后，-20 ℃保存。

（2）苯并咪唑类药物及其代谢物混合标准工作液（10 μg/mL）

分别准确吸取5-羟基噻苯咪唑、噻苯咪唑、胺基阿苯哒唑砜、阿苯哒唑亚砜、阿苯哒唑砜、奥芬哒唑、羟基甲苯咪唑、胺基甲苯咪唑、2-胺基-氟苯咪唑、芬苯哒唑砜、甲苯咪唑、阿苯哒唑、氟苯咪唑、芬苯哒唑标准储备液1.0 mL至100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀即得。配制完后，4 ℃保存。

（3）苯并咪唑类药物及其代谢物混合标准工作液（1 μg/mL）

准确吸取苯并咪唑类药物及其代谢物混合标准工作液（10 μg/mL）1.0 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀即得。配制完后，4 ℃保存。

2.3.2 样品的制备

（1）提取

称取（2±0.02）g试料加入2%碳酸钠溶液0.5 mL，再加入氯化钠2 g，加入乙酸乙酯8 mL，涡旋混合后，中速振荡提取5 min，6 000 r/min离心5 min，取上清液，重复提取一次，合并上清液至离心管中。40 ℃下吹至近干，向离心管中加入酸化乙醇溶液5 mL，涡旋混合1 min，超声5 min，再向离心管中加入正己烷5 mL，涡旋混合1 min，6 000 r/min离心5 min，弃去上层正己烷。再用正己烷5 mL重新脱脂一次，下层溶液作为备用液。

（2）净化

MCX小柱依次用甲醇、2%甲酸水溶液各3 mL活化，取全部备用液过柱，控制流速为1 mL/min，依次用2%甲酸水溶液、甲醇各3 mL以同样速度淋洗柱子，抽干，用5%氨水甲醇溶液3 mL洗脱于试管内；洗脱液于40 ℃下氮气吹干。

残余物加入20%甲醇+0.1%甲酸水溶液1 mL，超声10 min，充分涡旋混匀；过0.22 μm滤膜后供液相色谱－串联质谱仪测定。

2.3.3 测定

（1）液相色谱条件

色谱柱：Waters Xterra C18柱，（2.1×50）mm，1.7 μm；流动相：A相，0.1%甲酸乙腈溶液，B相，0.1%甲酸水溶液；梯度洗脱：洗脱程序见表1；流速：0.2 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 µL。（2）质谱参考条件

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；电离电压：3.0 kV；源温：110 ℃；雾化温度：350 ℃；锥孔气流速：50 L/h；雾化气流速：450 L/h；测试药物定性、定量离子对及对应的锥孔电压、碰撞能量，结果见表2。

（3）标准曲线绘制

以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，对照溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2.3.4 线性试验测定结果

表1 梯度洗脱程序

表2 苯并咪唑类药物及其代谢物定性、定量离子对，锥孔电压、碰撞能量和保留时间

线性试验测定结果如表3所示。

从线性回归方程及相关系数R2可以看出，14 种苯并咪唑类药物及其代谢物在10～1 000 ng/mL的浓度范围内呈现良好的线性关系，R2均大于0.99。

2.4 灵敏度试验

2.4.1 灵敏度试验方法

分别准确吸取1 μg/mL混合标准工作液10和20 μL，添加到2 g牛奶中，制得浓度为5 μg/kg和10 μg/kg的空白添加试料。按样品提取与净化步骤处理，残余物加入20%甲醇+0.1%甲酸水溶液1 mL溶解，充分超声、涡旋混匀，过0.22 μm滤膜后供高效液相色谱－串联质谱测定，计算信噪比。空白试样按同样的方法处理，得到空白试样的质量色谱图。

2.4.2 灵敏度试验结果

空白牛奶试样的测定结果表明，在相应的保留时间均无杂质干扰。检测限（LOD）考察结果：按信噪比S/N＞3（PtP）计，苯并咪唑类药物及其代谢物在5 μg/kg的添加水平上均符合要求，说明苯并咪唑类药物及其代谢物的检测限均能达到5 μg/kg。定量限（LOQ）考察结果：按信噪比S/N＞10（PtP）计，苯并咪唑类药物及其代谢物在10 μg/kg的添加水平上均符合要求，说明苯并咪唑类药物及其代谢物的定量限均能达到10 μg/kg。

表3 苯并咪唑类药物回归方程及相关系数（R2）

2.5 准确度和精密度考察

2.5.1 试验方法

采用标准添加法，在空白牛奶10、50、100和200 μg/kg共4 个不同浓度的苯并咪唑类药物及其代谢物，进行回收率试验，各浓度进行5 个样品平行试验。按样品提取与净化步骤处理，残余物加入20%甲醇+0.1%甲酸水溶液1 mL溶解，充分涡旋混匀，过膜后供高效液相色谱－串联质谱测定。重复3 次，求批内、批间相对标准偏差。

2.5.2 结果计算

式中：X—供试试料中苯并咪唑类药物及其代谢物残留量（μg/kg）；Cs—基质匹配溶液中相应苯并咪唑类药物及其代谢物浓度（ng/mL）；C—供试试料溶液中相应苯并咪唑类药物及其代谢物浓度（ng/mL）；As—基质匹配溶液中相应苯并咪唑类药物及其代谢物峰面积；A—供试试料溶液中相应苯并咪唑类药物及其代谢物峰面积；V—残余物定容体积（mL）；m—供试试料质量体积（g或mL）。

需要注意的是，计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留3 位有效数字。

2.5.3 准确度和精密度试验

准确度和精密度试验结果见表4。由表4可知，在10、50、100和200 μg/kg添加浓度水平上，本方法在空白牛奶中的回收率平均为70%～120%。批内、批间相对标准偏差均小于20%。

3 结果与讨论

3.1 线性范围

苯并咪唑类药物及其代谢物标准溶液在10～1 000 ng/mL的浓度范围内呈现良好的线性关系，R2均大于0.99，符合要求。

3.2 灵敏度

苯并咪唑类药物及其代谢物在牛奶中的检测限能达到5 μg/kg，定量限能达到10 μg/kg，均符合要求。

3.3 准确度

本方法在10、50、100和200 μg/kg添加浓度范围内，牛奶中苯并咪唑类药物及其代谢物的回收率均在70%～120%范围内，符合要求。

3.4 精密度

本方法在10、50、100和200 μg/kg添加浓度水平上，牛奶中苯并咪唑类药物及其代谢物的批内相对标准偏差均≤20%，批间相对标准偏差均≤20%，符合要求。

表4 空白牛奶中苯并咪唑类药物添加回收率试验（n=5）

3.5 检测方法的制定原因

为加强兽药残留监控工作，保证动物性食品卫生安全，农业部于2002年发布第235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》，其中规定了甲苯咪唑、阿苯哒唑、噻苯咪唑、氟苯咪唑、芬苯哒唑及主要代谢物在牛奶中的最高残留限量（MRL）。动物源产品中苯并咪唑类药物残留的检测方法，报道的有高效薄层色谱（HPTLC）等初筛方法、高效液相色谱荧光检测器测定方法（HPLC-FLD）、高效液相色谱质谱联用（LC-MS和LC-MS｜MS）等测定方法。由于LCMS/MS方法具有操作简捷、灵敏度高、定性准确等优点，所以将其应用于牛奶中苯并咪唑类药物及其代谢物残留检测方法的研究中，以保障对该类兽药的残留监控。

3.6 样品处理方法的确定

苯并咪唑类药物属于弱碱类化合物，在弱碱性条件下，呈游离分子状态，在酸性条件下，该类化合物质子化。因此本方法提取时采用碱性条件下用乙酸乙酯进行提取。

由于大多数苯并咪唑类药物溶于乙醇和稀盐酸溶液，因此本方法在合并2 次提取液浓缩蒸干后，采用了酸化乙醇溶液溶解浓缩物，既可以脱去提取样品中的蛋白质，也可以充分溶解该类药物，进一步经正己烷脱脂后通过固相萃取方法进行净化。对固相萃取柱C18柱、HLB柱、MCX柱等进行比较发现：HLB和MCX的药物添加回收率普遍较C18高；HLB和MCX之间差异不显著，但是使用HLB时，酸性乙醇溶液溶解的浓缩物在上样前需用碳酸钠溶液中和至中性，而使用MCX柱时，酸性乙醇溶液溶解的浓缩物可以直接过柱，因此操作起来比较方便，所以最终选择了用MCX固相萃取柱进行净化。

因此，本方法采用MCX柱，用甲醇、2%甲酸水溶液活化后，将提取液全部过柱，然后用5%氨化甲醇溶液洗脱，达到了理想的效果。另外，样品经氮吹仪浓缩、吹干后要充分超声溶解。

3.7 离子对的确定

苯并咪唑类药物属于欧盟指令96/23/EC附录IB组所列物质，根据欧盟2002/657/EC要求，要确证该类物质至少需要3 个识别点（IP），分别选择了母离子以及对应的2 个响应较强的子离子作为定性依据，这样1 个母离子获得1 个IP点，对应2 个子离子分别获得1.5 个IP点，达到了4 个IP点，很好地满足了欧盟有关法规的要求。