螺旋藻产品脂肪酸GC指纹图谱分析方法的研究

祖 新，李羽翡，仝伟建，杨晓楠

（甘肃省食品检验研究院，甘肃 兰州 730030）

螺旋藻（Spirulinasp.）是营养成分最全面、最均衡的食品之一；其含有丰富的蛋白质、氨基酸、多糖、不饱和脂肪酸、多种维生素、矿物质和微量元素等[1]。由于天然螺旋藻产量有限，不适合大工业生产，市场上的螺旋藻均为人工养殖产品，而伴随养殖企业规模、设备、技术以及选种的差异，其产品质量的好坏也突显出来，甚至假冒伪劣产品也充斥其中。因此，有必要建立能够标示其化学特征的指纹图谱，进而对螺旋藻产品质量进行有效描述和评价。

螺旋藻属于低脂肪含量的食品，脂肪含量约为6%～9%，而且其中多为不饱和脂肪酸和一些饱和脂肪酸，尤其是含有大量的十六碳酸（棕榈酸）、9-十六碳烯酸（棕榈油酸）、顺-9-十八碳烯酸（油酸）、顺-9,12-十八碳二烯酸（亚油酸）和顺-6,9,12-十八碳三烯酸（γ-亚麻酸）。多不饱和脂肪酸具有调节人体脂质代谢，维持神经系统发育，促进免疫等生理功能[2]。目前国内外虽然有多种脂质提取方法[3]，但技术实质仍是萃取。现代脂肪酸检测普遍采用色谱分离技术，尤其以气相色谱（gas chromatography，GC）法最为精确，实用[4]。螺旋藻保健功能主要依赖的生物活性物质是γ-亚麻酸[5]，特征性极强，因此，可以通过测定其脂肪酸组成，来绘制螺旋藻产品指纹图谱。本试验采用气相色谱法对螺旋藻产品的脂肪酸进行分析，通过内标加入，在测定脂肪酸比值同时，对目标组分定量检测，可绘制功能完善的指纹图谱[6]，对于提高螺旋藻产品质量，促进该保健食品现代化具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

螺旋藻产品样品：随机选取市售10种不同品牌螺旋藻片剂产品，分别用A～Z中10个英文字母表示；脂肪酸甲酯标准品（棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯、γ-亚麻酸甲酯、α-亚麻酸甲酯、山嵛酸甲酯、芥酸甲酯）、内标（富马酸二甲酯）：德国Labor Dr.Ehrenstorfer-Schafers公司；正己烷、氢氧化钾（KOH）、甲醇、硫酸氢钠：天津化学试剂一厂；所用化学试剂均为色谱纯。

1.2 仪器与设备

2010型气相色谱仪配火焰离子化检测器（flame ionization detector，FID）检测器：日本岛津分析仪器有限公司；SP-2560型毛细管色谱柱（100 m×0.25 mm×0.20 μm）、24DL型固相萃取仪：美国Supelco公司；T-25型高速均质机：德国IKA公司；L-530型离心机：湖南湘仪实验仪器开发有限公司；SK-1型涡旋振荡器：常州国华电器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品预处理[7-9]

称取10.0 g螺旋藻产品样品，加50 mL正己烷，用高速均质机均质破壁，使脂肪完全溶解，离心沉淀，取上清液10 mL进行分散固相萃取（dispersive solid-phase extraction，DSPE）净化，以去除叶绿素等干扰，得到螺旋藻净化液。

1.3.2 供试品溶液的制备[10-12]

取螺旋藻净化液5 mL，加0.5 mL 2 mol/L KOH-甲醇溶液（称取11.3 g KOH溶解于100 mL甲醇），涡旋振荡2 min，50 ℃、30 min完成酯交换反应使油脂甲酯化，静置至澄清，向溶液中加入约1 g硫酸氢钠，猛烈振摇，以中和剩余的氢氧化钾，4 000 r/min离心5 min，取上清液2 mL，转入样品瓶，即为供试品溶液。

1.3.3 标准溶液配制

准确配制质量浓度分别为0.1 mg/mL的棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和γ-亚麻酸等脂肪酸甲酯正己烷溶液，制得标准溶液。标准溶液用于脂肪酸组分定性分析。

1.3.4 色谱条件

程序升温：初始温度120 ℃，保持0 min；以10 ℃/min升温至230 ℃保持30 min；汽化室温度：250 ℃；检测器温度：300 ℃；载气（N2）流速：0.5 mL/min，氢气流速：40 mL/min；空气流速：300 mL/min；隔膜吹扫：3 mL/min；进样量：1.0 μL；分流比：50∶1。

根据标准溶液色谱峰的保留时间，对样液各组分色谱峰定性，采用峰面积归一法对脂肪酸各组分定量检测。

2 结果与分析

2.1 脂肪酸标准品的气相色谱检测

脂肪酸混合标准品的气相色谱检测结果见图1。

图1 脂肪酸标准品气相色谱图Fig.1 Gas chromatogram of fatty acids standard

由图1可知，出峰时间为34.586 min、37.450 min、38.922 min、41.114 min、42.946 min、44.088 min、45.867 min、48.465 min分别对应的脂肪酸标准品为棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、γ-亚麻酸、山嵛酸及芥酸。结果表明，各色谱峰峰形对称，基线平稳，分离度好。

2.2 内标物气相色谱检测

选取富马酸二甲酯作为内标物，配制成质量浓度为1.00 g/mL内标液，在相同色谱条件下进样测试，得到内标物GC色谱图如图2所示。

图2 内标物气相色谱图Fig.2 Gas chromatogram of internal standard

由图2可知，富马酸二甲酯可在该色谱条件下完全分离，且化学性质稳定，初步符合内标物选择要求[13-14]。

2.3 加入内标的螺旋藻产品中脂肪酸色谱图

在供试品测定液中准确加入1.0 μL 1.00 g/mL内标液，在相同色谱条件下进样测试，得到加入内标的螺旋藻产品脂肪酸色图谱如图3所示。

图3 加入内标的螺旋藻产品脂肪酸色谱图Fig.3 Chromatograms of fatty acids in spirulina products with internal standard

由图3可知，内标物与螺旋藻产品脂肪酸组分出峰时间完全分离，同被测组分有相似检测响应，且无干扰，该内标物适用脂肪酸检测。

2.4 螺旋藻产品中脂肪酸指纹图谱的建立

分别取10个品牌螺旋藻产品供试品测定液各1.5 mL于样品瓶，准确加入1.0 μL 1.00 g/mL富马酸二甲酯内标液，振荡混匀，注入气相色谱仪，记录60 min色谱图，根据10个样品的相对保留时间及指纹图谱的整体谱峰特点对峰进行匹配，以保留时间的平均数建立共有模式，脂肪酸气相色谱指纹图见图4。

图4 螺旋藻产品脂肪酸指纹图谱Fig.4 Fingerprint of fatty acids in spirulina products

根据10个品牌不同供试品指纹峰的相对保留时间和峰面积的检测结果，确定了6个共有峰作为螺旋藻脂肪酸指纹图谱的特征指纹峰，脂肪酸的分析结果见表1。

由表1可知，该测试条件下，10批螺旋藻产品供试品中单峰面积占总峰面积＞10%的主要共有峰为：2号峰（43.5%～51.2%）、5号峰（17.2%～21.6%）及6号峰（12.3%～23.0%），这三个主要共有峰面积占总峰面积比值均＞83%，特征明显，而共有峰总面积占总峰面积比值均＞95%，非共有峰面积占总峰面积比值均＜5%，符合指纹图谱规定要求[15-17]。根据10批供试品的检测，可以看出多种组分含量上有明显不同，其中螺旋藻生物活性物质γ-亚麻酸含量波动在12.3%～23.0%，相对差值高达61%。

表1 10个品牌螺旋藻产品中脂肪酸的分析结果Table 1 The analysis results of 10 batches of fatty acids in spirulina products

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验

取同一螺旋藻产品供试品溶液，在相同的气相色谱条件下连续检测5次，考察各色谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果见表2。

由表2可知，各色谱峰保留时间和脂肪酸质量浓度的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）均＜3%，说明此方法精密度良好，符合指纹图谱规定要求。

表2 精密度试验结果Table 2 Results of precision experiments

2.5.2 重复性试验

取同一批螺旋藻产品分别制备供试品溶液6份，分别注入气相色谱仪，考察各色谱峰相对保留时间、相对峰面积的一致性，结果如表3所示。

表3 重复性试验结果Table 3 Results of the repetitive experiments

由表3可知，各色谱峰相对保留时间和峰面积比值的RSD均＜3%，说明重复性良好，符合指纹图谱规定要求。

2.5.3 稳定性试验

取同一螺旋藻产品供试品溶液，分别在0（1#）、2 h（2#）、4 h（3#）、8 h（4#）、16 h（5#）时，室温（25 ℃）条件下进行检测，考察各色谱峰相对保留时间、相对峰面积的一致性，结果如表4所示。

由表4可知，螺旋藻产品供试品溶液在16 h内，各色谱峰保留时间和峰面积比值的RSD均＜3%，说明稳定性良好，符合指纹图谱规定要求。

表4 稳定性试验结果Table 4 Results of the stability experiments

3 结论

螺旋藻产品脂肪酸组分GC测定方法可靠、简便、重现性好，按相关技术标准要求，可用于指纹图谱的建立。本研究建立的螺旋藻产品脂肪酸GC指纹图谱绘制方法，经方法学考察，该方法精密度、重复性和稳定性良好，均符合指纹图谱规定要求。结果反映了螺旋藻指纹图谱建立的实用性，可用于评价螺旋藻产品质量的依据。

[1]王传荣.螺旋藻保健鲜啤酒的研制[J].中国酿造，2006，25（4）：74-76.

[2]董 华，樊超男，王 翠，等.n-3 脂肪酸变化对仔鼠脑源性神经营养因子基因表达的影响[J].中国儿童保健杂志，2014，22（5）：488-491.

[3]贺赐安，余旭亚，赵 鹏，等.微藻油脂提取方法研究进展[J].中国油脂，2012，37（8）：16-20.

[4]陈亚飞，程速远，孙 宇.毛细管气相色谱法测定海狗油胶丸中X-3多不饱和脂肪酸的含量[J].药物分析杂志，2011，24（5）：499-501.

[5]陈伟平.螺旋藻的化学成分分析及药效学研究[J].中药材，2000，23（8）：470-473.

[6]任德权.中药指纹图谱质控技术的意义与作用[J].中药新药与临床药理，2002，12（3）：135-141.

[7]程小雪，袁永俊，胡丽丽，等.中温浸提法制备食用花椒调味油及其成分分析[J].中国酿造，2014，33（2）：42-46.

[8]郑 平，陈晓辉，毕开顺.辛夷挥发油的GC 指纹图谱[J].沈阳药科大学学报，2009，26（4）：303-306.

[9]许 华，潘灿平.气相色谱-质谱法分析螺旋藻中脂肪酸[J].食品科学，2009，30（22）：280-282.

[10]孙 博，侯冬岩，回瑞华.螺旋藻中脂肪酸的GC-MS 分析[J].鞍山师范学院学报，2010，12（4）：36-38.

[11]陈小萍，郑丽红，林国斌，等.不同产地螺旋藻中脂肪酸的GC-MS 分析比较[J].中国卫生检验杂志，2000，10（4）：404-405.

[12]邹耀洪，螺旋藻脂肪酸2-氨基-2-甲基丙醇化学修饰气相色谱-质谱分析[J].食品科学，2006，27（2）：202-206.

[13]王 燕，王 芸，孙文基.气相色谱内标法同时测定土木香中土木香内酯、异土木香内酯的含量[J].武警医学院学报，2010，19（7）：527-529.

[14]李 伟，陈华勇，张 凯，等.气相色谱内标法测定鱿鱼油中的胆固醇[J].食品工业科技，2011，32（1）：284-289.

[15]张卫军.苦瓜皂苷的分离纯化及其指纹图谱的建立[D].哈尔滨：东北农业大学硕士论文，2008.

[16]魏 刚.中药GC-MS 指纹图谱的方法学探讨[J].中药新药与临床药理，2005，16（1）：73-76.

[17]范骁辉，叶正良，程翼宇.基于信息融合的中药多元色谱指纹图谱相似性计算方法[J].高等学校化学学报，2006，27（1）：26-29.