产纤溶酶海洋放线菌的筛选及初步鉴定

董 超，米 阳，原晋波，史延茂

（1.河北省科学院 生物研究所，河北 石家庄 050081；2.河北工业大学 化工学院，天津 300130）

血栓导致的心脑血管病一般表现为心梗和中风，现在临床的治疗方案以溶栓为主，溶栓药物包括链激酶（streptokinase，SK）、尿激酶（urokinase，UK）、蚓激酶、葡激酶、组织型纤溶酶原激活剂（tissue-type plasminogen activator，t-PA）和瑞替普酶，还有目前研究较热的纳豆激酶等，它们在不同方面存在一定缺陷，如有免疫反应、对血液纤维蛋白专一性差、半衰期短或价格昂贵等[1]。纳豆激酶虽然无上述缺点，但是由于出血倾向未有定论，目前还没有药品注册登记[2]。尿激酶由于来源特殊，价格与成本差距较小，近年来已经逐步退出市场。蚓激酶和蛇毒溶栓酶来自动物，容易受养殖成本的影响。由于微生物发酵具有周期短、规模易扩大、提取工艺可控等优点，所以微生物发酵生产临床的纤溶酶逐渐成为主流。陆地微生物中一些产纤溶酶的菌株包括：枯草芽孢杆菌（纳豆芽孢杆菌）、假单胞菌、链霉菌、根霉、曲霉和蛹虫草真菌等[3-4]。

海洋蕴藏着丰富的微生物资源，绝大多数的海洋微生物还没被人类认识和培养。由于海洋的高盐、低温、低营养等特殊环境，海洋微生物的代谢途径与陆地微生物差异较大，可以产生特殊结构的次级代谢产物[5]。本研究采用加入抑制剂和诱导剂的筛选方法，从秦皇岛海域和天津海滨的海水和海泥样本中，获得了分布特征差异较大的菌株，并且得到了一株产纤溶酶的链霉菌菌株，对该菌株进行了初步的鉴定。针对海洋微生物产物的多样性和新型溶栓药物的开发进行了探索。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品及化学试剂

牛纤维蛋白原：美国Sigma公司；凝血酶：石家庄市华瑞创新生物科技开发中心；注射用尿激酶：辽宁卫星制药厂有限责任公司；K2Cr2O7（分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；青霉素、杆菌肽：华北制药集团股份有限公司；四环素：北京赛孚制药股份有限公司；环丙沙星、庆大霉素：新乡市常乐制药责任有限公司。海水取自渤海湾，取样参数见表1。海泥取自天津滨海新区海湾，取样参数见表2。

表1 渤海湾海水样本取样参数Table 1 Seawater sampling parameters in Bohai Bay

表2 天津滨海新区海湾海泥样本取样参数Table 2 Seamud sampling parameters in Tianjin Binhai New District Bay

1.1.2 培养基

Luria-Bertani（LB）海水培养基：蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，pH 7.0～7.2，用模拟海水配制，固体需要加琼脂1.5%。

PB培养基：蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.0～7.2，固体需要加琼脂1.5%。

高氏1号海水培养基：淀粉硝酸盐培养基用模拟海水配制。

蛋白酶筛选培养基：LB固体培养基加入0.5%的灭菌奶粉。

纤溶酶筛选培养基：纤维蛋白原80 mg溶于75 mL 0.2 mol/L磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）中，凝血酶4 mg溶于5 mL同样缓冲液中。将100 mL LB培养基化开，冷却到50 ℃，先将纤维蛋白原溶液加入，搅拌，然后加入凝血酶，搅拌均匀。迅速倒平板，备用。

目标菌株的摇床培养：海水LB培养液装量50 mL/250 mL，培养温度24 ℃，转速150 r/min，培养3 d，得发酵液。

模拟海水配方：NaCl 26.73 g/L，MgCl22.26 g/L，MgSO43.24 g/L，CaCl21.15 g/L，NaHCO30.20 g/L，KCl 0.72 g/L，NaBr 0.06 g/L，H3BO30.05 g/L，LiNO30.0013 g/L。

1.2 仪器与设备

PW/10-002台式保温培养箱：重庆实验设备厂；BX41显微镜：日本Olympus公司；SKY2102C摇床：上海苏坤设备有限公司；MyCycler PCR仪：美国伯乐公司；DYCP-31C电泳仪：北京六一仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 海水和海泥样本的保存

海水取样每瓶200 mL，先冷藏，然后每瓶分装到50 mL灭菌离心管，取一瓶进行实验，其余液氮保存，以备重复或进一步筛查。

1.3.2 样本的预处理

从不同瓶的海水样本中分别吸取1 mL，每10个瓶取10 mL，合并混匀，备用；海泥样本或动物带泥沙分别称质量约10 g混合，再与模拟海水以质量比1∶5混合，摇床振荡30 min，备用。

1.3.3 样本初筛

取海水样本直接涂平板，取海泥样本中加入0.1%吐温-80，在25 ℃条件下培养。将各培养平板的菌株进行初步分类（外观、镜检）。

1.3.4 抑制细菌和真菌的样本筛选[6]

取海水、海泥样本分别加入灭菌的K2Cr2O7溶液使质量浓度达到50 μg/mL、100 μg/mL、500 μg/mL、1 000 μg/mL、1 500 μg/mL、2 000 μg/mL、3 000 μg/mL，在25 ℃条件下振荡8 h，涂平板，与1.3.3比较菌落数量的变化。

1.3.5 纤维蛋白的制备

在培养液中添加一定量的诱导底物，以利于目标菌株的筛选。纤维蛋白的制备方法采用抗凝血浆冻融法[7]。

1.3.6 纤溶酶酶活的测定方法

纤溶酶活性测定方法参照改进型琼脂糖纤维蛋白平板法进行测定[8]。

1.3.7 产蛋白酶的菌株条件筛选

将800 μg/mL K2Cr2O7处理的海泥样本涂布于蛋白酶筛选培养基，25 ℃条件下培养2～5 d，观察菌落透明圈。

1.3.8 产纤溶酶的菌株初筛

将纤维蛋白原220 mg和凝血酶11 mg加入模拟海水中配制成500 mL，加入1.3.7处理样本的上清液5 mL，在25 ℃条件下摇床培养7～10 d，取0.1 mL涂布于纤溶酶筛选培养基的平板，观察菌落透明圈。

1.3.9 产蛋白酶菌株复筛

将1.3.7筛选得到有透明圈的菌落分别划线接种到纤溶酶筛选培养基中，观察菌落透明圈。

1.3.10 产纤溶酶菌株的菌落特征

将复筛所得的产纤溶酶菌株接入LB培养液中，25 ℃、140 r/min，培养15～18 h；同时接入LB固体培养基内，25 ℃，培养1～5 d，镜检。分别在显微镜下观察液体内菌丝和固体培养的菌株生长状态。

1.3.11 菌株生理生化鉴定

参照《放线菌快速鉴定与系统分类》、《伯杰细菌鉴定手册》鉴定方法进行生理生化鉴定。

1.3.12 菌株的16S rRNA鉴定

16S rRNA序列的测定由宝生物工程（大连）有限公司完成。将拼接好的序列于CNBI网站进行Blast对比得到相近菌株，根据同源性选取模式菌株通过MEGA 5.1用Neighbor-Joining法构建系统发育树，Bootstrap检测1 000次[9]。

1.3.13 目标菌株的抑菌实验

MY0504的发酵液用0.45 μm滤膜过滤除菌，得到透明发酵滤液。采用3类菌株进行发酵滤液的抑菌试验。致病菌：大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌；益生菌：纳豆芽孢杆菌、酵母菌；霉菌：黄曲霉、木霉、黑曲霉。实验方法按照牛津杯抑菌法[10]。

1.3.14 常用抗生素对目标菌株的抑制作用

将MY0504菌株的孢子用接种环挑取少部分在10 mL无菌水中稀释，高速摇匀，备用。将100 mL PB培养基化开降温到45 ℃左右，加入2 mL备用的孢子菌液，摇匀，铺平板。配制青霉素、四环素、环丙沙星、庆大霉素、杆菌肽溶液，取10 μL点到上述平板上，24 ℃恒温培养3 d，测定抑菌圈的大小。

2 结果与分析

2.1 样本的直接涂布菌落特点

海水和海泥样本的总体菌落分布和菌落特征如表3所示。海水的样本直接涂布后，第2天可见芽孢类细菌，其生长速度快，菌落大，颜色分别是无色和棕红色；第3天可见小的细菌菌落，菌落小而圆，透明，镜检为弧菌。再继续培养到5～6 d，在细菌菌落外出现白色霉菌菌丝；未见到放线菌落。海泥的样本菌落数在106稀释涂布后，菌落以芽孢类细菌为主，可能由于稀释倍数太高，所以没发现其他细菌、霉菌和放线菌。

表3 海水和海泥样本的直接涂布菌落分类情况Table 3 Colonies classification of seawater and seamud samples by direct spreading method

由表3可知，芽孢类细菌是海洋样本中的主要菌群，这可能与采样区域距海岸较近、并且水深在10多米左右有关，该菌群推测应该是陆地微生物的海洋水域延伸。霉菌由于对碳源挑剔，喜欢酸性环境，所以在海洋样本中较少；放线菌类由于太少，在海水直接涂布情况下不能筛出。针对海洋微生物的筛选，首先要去除陆地微生物的延伸扩散影响，然后采取诱导或富集手段，才能得到目标微生物。海泥样本的芽孢菌菌落数大约是海水的106～107倍。

2.2 海泥样本加入抑制剂后的筛选结果

图1 重铬酸钾对海泥菌落数量的抑制作用Fig.1 The suppression effect of potassium dichromate on the quantity of colony from sea mud

海泥样本直接涂布数量太多，加入抑制剂K2Cr2O7后的菌落数量变化如图1所示。由图1可知，菌落数量随着K2Cr2O7质量浓度增高，菌落数呈近似级数降低，在K2Cr2O7质量浓度500 μg/mL时菌落数量降至原来的25%左右。本实验采取800 μg/mL K2Cr2O7的质量浓度来降低菌落数量，海泥样本的菌落数可以降低到原来的5%左右。K2Cr2O7的抑菌效果与高氧化还原电位有关，文献报道K2Cr2O7的含量达到2.5%时处理18 h，芽孢杆菌均可以被杀灭，但是对放线菌等的抑菌效果较小[11]。

2.3 产蛋白酶菌株的筛选结果

通过海泥样本的蛋白酶平板筛选，发现3类菌株具有透明圈，通过镜检和外观分辨，基本确定为表3中的两种芽孢菌和弧形菌具有蛋白酶活性，结果见图2。

图2 牛奶蛋白平板菌落的生长状况Fig.2 The growth state of colonies in milk-protein plate

由图2可知，将单菌落菌株在纤溶酶平板上划线培养，均没有纤维蛋白溶解圈，这说明产蛋白酶的菌株均不能产纤溶酶。同时也从侧面证明了酪蛋白筛选平板只能用作产蛋白酶菌株筛选，不能用于产纤溶酶菌株的筛选，而用纤维蛋白筛选平板比较合适。

2.4 产纤溶酶菌株的条件筛选

海泥样本通过K2Cr2O7筛选后，芽孢杆菌数量大幅度减少，并在模拟海水的高盐环境中长时间培养后，一些不耐高盐环境的菌落被排除，这将有助于海洋菌株的筛选。纤维蛋白通常是相同二级结构的多肽链，不同动物之间的血纤肽可能氨基酸序列有差别，但是其支架结构的连接键大同小异，这也是纤溶酶的作用位点[12]。由于海水环境营养匮乏，采取加入纤维蛋白诱导物，可能会提高筛选得到分泌纤溶酶菌株的几率。

结果显示，在纤维平板培养4 d后长出了不同于先前菌落的似放线菌株，命名为MY0504，并且菌落边缘有明显的透明圈，结果见图3（照片为培养平板的背部图），上部为MY0504菌株的透明圈，下部棕红色为棕红色芽孢菌株，周边无透明圈，说明不能产生纤溶酶。

目标菌株MY0504在LB培养基上生长旺盛，结果见图4。该试验证明采用添加抑制剂除去非目标菌株和附加纤维蛋白诱导目标菌株培养两种方法相结合，从海泥样本中可以筛选得到产纤溶酶的微生物菌株。目标菌株的筛选采用单一手段比较困难，一般都要采取两种以上的附加方法，可以大大提高目标菌株的筛选几率[13]。

图3 纤维蛋白平板的菌落生长状况Fig.3 The growth state of colonies in fibrin plate

图4 MY0504在LB培养基上的生长状况Fig.4 The growth state of strain MY0504 in LB culture

2.5 生理生化实验结果

表4 分离株MY0504的生理生化特性Table 4 Biochemical and physiological characteristics of isolated strain MY0504

通过系列实验测定[14-15]，该菌株培养条件为温度15～40 ℃，pH 6～14，NaCl 1%～10%。其他生理生化指标见表4。由表4可知，该菌株基本不利用淀粉和纤维素等碳源，可以利用铵基做氮源，分解碳源的酶系较少，分解氮源的酶相对较多。

2.6 电镜观察

图5 MY05054菌株孢子丝的电镜图Fig.5 Electron micrographs of strain MY0504 spores

目标菌株MY0504的孢子丝电镜观察结果如图5所示。由图5可知，目标菌株MY0504孢子表面光滑，无刺有褶皱；孢子丝无螺旋，但是有分支。由菌丝状态可以确定该菌株不属于诺卡氏菌属、动孢菌属、间孢囊菌属和多形态放线菌属，应该属于链霉菌属或北里孢菌属[16]。

2.7 目标菌株的分子生物学鉴定

目标菌株MY0504的16S rDNA扩增结果电泳图见图6。由图6可知，其基因序列包含1 406 bp。菌株菌株MY0504测序结果见图7，序列在美国国家生物技术信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）网站进行Blast，对比发现菌株MY0504与链霉菌属（Streptomyces）菌株高度相关，认定该菌株属于链霉菌属（Streptomyces），该菌株与S.albusNBRC 13689、S.canescens、S.canescens1、S.coelicolor、S.albidoflavus、S.limosus有较近的亲缘关系。

图6 MY0504菌株PCR扩增结果Fig.6 PCR amplification results of strain MY0504

图7 菌株16S rDNA 用NJ 法构建的系统进化树Fig.7 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequences from strain isolates using the Neighbor-Joining method

2.8 目标菌株的抑菌实验结果

通过实验发现，3类菌都在牛津杯周围正常生长，没有任何抑菌圈出现，说明MY0504基本不产抗生素。该菌株发酵产纤溶酶，如果发酵液中含有抗生素成分，会影响其药物开发应用，所以该菌株不产抗生素成分利于菌株在纤溶酶方面的开发应用。

2.9 常用抗生素对目标菌株的抑制作用

抗生素周边某一直径的抑菌圈表示对药物敏感，小于或没有说明该菌株对抗生素有抗性。采用Kirby-Bauer的检测方法，参照各抗生素的敏感直径得出MY0504的敏感程度如表5所示。由表5可知，该菌株对这5种抗生素比较敏感，所以该菌株的实验开发等是相对安全的，不会引起不可控制的感染等，这也利于该菌株的纤溶酶发酵应用。

表5 菌株MY0504对常用抗生素的敏感程度Table 5 The sensitivity of strain MY0504 to general antibiotics

3 结论

本研究采用低营养、长时间的培养，同时只提供纤维蛋白做为营养诱导物，筛选得到了产纤溶酶的链霉菌菌株MY0504。

通过16S rRNA鉴定、生理生化实验和电镜观测，综合鉴定MY0504属于链霉菌属（Streptomyces）菌株，该菌株与S.albusNBRC 13689、S.canescens、S.canescens1、S.coelicolor、S.albidoflavus、S.limosus有较近的亲缘关系。

通过抗生素抑制法发现，该菌株基本不产抗生素成分，同时对常用抗生素比较敏感，所以采用MY0504菌株开发纤溶酶是比较合适的。

[1]KUNAMNENI A,RAVURI B D,SAISHA V,et al.Urokinase-a very popular cardiovascular agent[J].Recent Pat Cardiovasc Drug Discov,2008,3(1):45-58.

[2]FUJITA M,NOMURA K,HONG K,et al.Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme(nattokinase)in the vegetable cheese natto,a popular soybean fermented food in Japan[J].Biochem Bioph Res Co,1993,197(3):1340-1347.

[3]MITSUHIRO U,TOSHIHIRO K,KAZUTAKA M.Takumi nakamura purification and characterization of fibrinolytic alkaline protease fromFusariumsp.BLB[J].Appl Microbiol Biotechnol,2007,74(2):331-338.

[4]刘晓兰，张雯舒，郑喜群，等.蛹虫草发酵产纤溶酶的分离纯化[J].华南理工大学学报：自然科学版，2012，40（5）：107-114.

[5]KNIGHT V,SANGLIER J J,DITULLIO D,et al.Diversifying microbial natural products for drug discovery[J].Appl Microbiol Biotechnol,2003,117(11):1-28.

[6]郭 亮，邢晓旭，郑明学，等.重铬酸钾对细菌活性的影响[J].山东畜牧兽医，2009，30（3）：4-7.

[7]李敏康，钱东明.冻融法提取猪血纤维蛋白原[J].分析实验室，2007，26（4）：65-68.

[8]杨 明，董 超，史延茂，等.纤维蛋白平板法测定纳豆激酶方法的改进[J].中国酿造，2008，27（7）：77-80.

[9]SAITOU N,NEI M.The neighbor-joining method:a new method for reconstructing phylogenetic trees[J].Mol Biol Evol,1987,249 (4):406-425.

[10]J.P.哈雷.图解微生物实验指南[M].北京：科学出版社，2012.

[11]陈菲菲，王 勇，王以光，等.海洋微生物来源的天然产物开发研究进展[J].应用与环境生物学报，2011，17（2）：287-294.

[12]王镜岩，朱圣庚，徐长法.生物化学[M].第三版.北京：高等教育出版社，2002.

[13]司美茹，薛泉宏，来航线.放线菌分离培养基筛选及杂菌抑制方法研究[J].微生物学通报，2004，31（2）：61-65.

[14]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.

[15]S.A.瓦克斯曼.放线菌（第二卷，属和种的分类、鉴定和描述）[M].北京：科学出版社，1974.

[16]阮继生，黄 英.放线菌快速鉴定与系统分类[M].北京：科学出版社，2011.