王佩佩,刘建龙 *,史建国,李 亮
(1.山东师范大学 生命科学学院,山东 济南 250014;2.山东省科学院生物研究所,山东省生物传感器重点实验室,山东 济南 250014;3.山东省食品发酵工业研究设计院,山东 济南 250013)
小麦作为一种重要的农产品,主要种植于我国中北部地区,长期以来,小麦多用于面粉生产。蛋白质是小麦粉中的第二大组分,其质量约占面粉总质量的11.5%~12.5%,其胚乳中蛋白质最多,约占麦粒中蛋白质总量的70%~80%,而且这部分蛋白质主要由能形成面筋的麦谷蛋白和麦胶蛋白组成,对面粉的烘焙性能起着决定性的作用[1]。
小麦面筋蛋白(俗称谷朊粉),是小麦淀粉生产的副产物,其蛋白质含量高达75%~85%,含有人体必需的15种氨基酸,是一种营养丰富、物美价廉的植物蛋白源[2]。由于其自身特有的氨基酸组成,使得它的溶解性低,限制了小麦蛋白肽的应用,可以通过酶法水解小麦面筋蛋白来获得水溶性较好的生物活性肽。小麦蛋白的应用可以提高小麦深加工中副产物的利用率,提高小麦产品的附加值。
经研究表明,人体摄入的蛋白质经自身消化系统中的酶作用后,并不是以氨基酸的形式被吸收,而更多的是以低肽的形式被吸收。许多蛋白肽不仅能提供人体生长发育所必须的营养与能量,还有着提高机体免疫力、降血压等广泛的生理活性。蛋白水解物或由蛋白水解物制备的活性肽类食品,具有易消化、易吸收、抗过敏性等特点[3]。因此,国外对活性肽的研究非常活跃,越来越多的活性肽被发现、提取并鉴定。目前,国际市场上已有谷蛋白肽产品,相对来说我国对谷蛋白肽的研究较少,特别是对小麦蛋白肽的研究非常少。因此,进一步的通过生物法改性小麦蛋白,研发小麦活性蛋白肽类制品,提高小麦蛋白的附加值迫在眉睫。
肽是蛋白质水解物,也就是蛋白质的结构片段。两个氨基酸分子之间是通过脱水缩合形成肽键来连接的,两个氨基酸形成二肽,多个氨基酸就形成了多肽。虽然与蛋白质的分子相比,肽的分子很小,但是肽具有很高的生物活性。活性肽是一类相对分子质量<6 000 u,具有多种生物学功能的两个或两个以上的氨基酸以肽键相连的化合物[4]。小麦肽的组成成分如表1所示[5]。
小麦蛋白肽的结构特点是在小麦蛋白中重复出现,并且存在着2种构象,即β-转角和聚脯氨酸II样的结构,低温时聚脯氨酸II样构象占优势,高温时β-转角构象占优势,这种重复序列肽还参与了分子间β-折叠的形成,这些肽决定着小麦蛋白的结构[6]。
表1 小麦肽的组分Table 1 The components of wheat peptides
研究发现,植物蛋白酶解物及其生物活性肽类物质不仅能作为氨基酸供体,在体内具有优良的消化吸收性能,也是一类生理调节剂,在体内参与机体免疫调节,具有降血压、抗氧化、抗血栓、改善脂质代谢、抗肥胖、抑制胆固醇、促进矿物质吸收等作用[7-10]。
张亚飞等[11]用碱性蛋白酶水解小麦蛋白,得到小麦肽混合物,经过实验鉴定了此混合物中含有刺激小鼠体外淋巴细胞增殖的活性肽,而且这种活性肽还具有一定的免疫活性;ZHU K X等[12]采用几种体外试验系统研究了小麦胚芽蛋白水解物(wheat germ protein hydrolyzate,WGPH)的抗氧化活性和清除自由基活性,结果显示,WGPH的抗氧化活性接近于亚油酸乳液体系中的α-生育酚,WGPH具有清除1,1-二苯基-2-苦基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl hydrate,DPPH)自由基、过氧化物和羟基自由基的活性,而且其清除自由基的效能与剂量有关,另外WGPH还表现出了显著地还原能力和强大的亚铁离子螯合效能。总体来说小麦胚生物活性肽具有很好的体外抗氧化活性。
MATSUI T等[13]在小麦胚芽蛋白的水解物中提取出了几种能降血压的血管紧张素I型转换酶抑制活性肽;焦谷氨酰亮氨酸(从小麦麸质水解物的生物活性肽)摄取显示出,以防止在小鼠葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎[14]。小麦肽可以防止由非类固醇抗炎药(nonsteroidal antiinflammatory drugs,NSAIDs)诱导的大鼠胃损伤,其保护作用的机理很可能是通过降低NSAID诱导的氧化应激[5]。小麦面筋蛋白衍生肽含不超过13个氨基酸,可唤起在I型糖尿病病人的T细胞反应[15]。目前小麦肽的体内活性还不是很明确,其功能和作用机理还需进一步研究。
多肽的制备方法一般分为化学水解法、化学合成法、DNA重组技术合成法、微生物发酵法和蛋白酶解法。相对于其他的短肽制备方法,蛋白酶酶解法制备短肽具有成本低、安全性好、生产条件温和、水解容易控制、对设备条件要求不高、便于工业化生产的优点[16]。
3.1.1 蛋白酶酶解法原理
蛋白质的酶法水解就是在一定的条件下利用蛋白水解酶催化蛋白质分子的水解,使得大分子的蛋白质降解成不同长度的小链分子。酶分子是一种具有一个或若干个活性部位的特殊的蛋白质分子,不同的酶有不同的活化中心,能水解不同的蛋白质,因此选择不同的蛋白酶水解小麦蛋白,得到的生物活性肽在产率、含量和性质上存在差异。
3.1.2 酶法水解中蛋白酶的选择
(1)不同的单酶水解
马洪龙等[17]用碱性蛋白酶(alcalase)水解小麦面筋蛋白,通过实验确定了最佳反应条件为pH 8.0,酶质量分数4%,温度70 ℃,反应时间150 min,底物质量分数7%。在此条件下,酶解产物中的Gln含量高且肽含量高;孔祥珍等[18]以大豆分离蛋白和谷朊粉为原料,选择碱性蛋白酶酶解制备植物蛋白肽粉,研究结果表明,相同条件下谷朊粉的酶解程度和氮回收率比大豆分离蛋白的高;张锐昌等[19]利用胃蛋白酶水解小麦蛋白制备小麦肽,其最佳水解条件为温度41 ℃、pH 2.0、底物质量分数2%、加酶量1 500 U/g。此时,水解度为7.8%,小麦肽的得率为55.95%;YANG F W[20]以小麦蛋白为原料,通过酶(中性蛋白酶即巯基蛋白酶)解技术制备生物活性肽,再用离子交换与分子筛净化技术进行提纯,从而形成了制备小麦高免疫生物活性肽的提取工艺和技术;王辛等[21]研究了小麦蛋白的酶(复合风味蛋白酶)法水解工艺,得出最佳水解条件为底物质量分数5%,水解时间6 h,酶用量50 LAPU/g,pH 6.0,水解温度50 ℃。王岁楼等[22]分别采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶对小麦蛋白进行水解,最终结果显示,作用效果最佳的是胃蛋白酶。
采用单酶水解小麦蛋白,可直接得到成品,成本低,操作简单,有效肽的含量高。碱性蛋白酶主要是由枯草杆菌蛋白酶A构成的一种碱性蛋白酶,与其他非动物性的蛋白酶相比,其水解效率非常高;胃蛋白酶、胰蛋白酶是动物蛋白酶,木瓜蛋白酶是植物蛋白酶,植物蛋白酶相对于碱性蛋白酶等微生物蛋白酶来说,不需要做毒理试验和临床试验证明酶和多肽有无危害性,可以直接使用。植物蛋白酶来源广,且多来源于生产的下脚料和副产品。
(2)复合酶水解
复合酶水解蛋白水解度高,所得产物澄清透明、苦味低,所以水解蛋白质时广泛使用复合酶。孙丽平等[23]通过实验研究发现,用风味酶和碱性蛋白酶复合来水解小麦蛋白有比较好的效果;SUN J等[24]采用复合酶(碱性蛋白酶、小麦蛋白水解专用酶)水解小麦面筋蛋白制备小麦肽,通过实验确定了制备小麦肽的最佳酶解条件为反应时间2 h,酶比例2∶1,反应温度50 ℃,pH 8.5,在此条件下,酶解得到的小麦肽的水解度较高,可达到29.9%;潘丽军等[25]采用碱性蛋白酶和胰蛋白酶分步水解小麦蛋白,实验确定的最佳条件为碱性蛋白酶在温度60 ℃、酶用量1.5%、底物质量分数4%、pH 9.5的条件下水解2 h,在此条件下的水解度为21.25%,再用胰蛋白酶在温度40 ℃、酶用量1.5%、pH 9.0的条件下水解2 h,此时水解度提高了3.30%,活性肽产品的得率为61.38%。
(3)其他
HE R H等[26]建立了一种高效酶膜反应器(enzyme membrane reactor,EMR)从小麦胚芽分离蛋白(wheat germ protein isolates,WGPI)中制备血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制肽。结果显示,连续EMR方法表现出较高的蛋白质转化率(55.3%)和肽的半抑制浓度(50% inhibitory concentration,IC50)(0.50 mg/mL)。与传统的酶催化水解方法相比,蛋白质的转化率显著增加36.17%,肽的IC50显著减少了30.6%。因此,连续的EMR有利于从WGPI中高效生产ACE抑制肽。
重组DNA技术(recombinant DNA technique)又称遗传工程,在体外重新组合脱氧核糖核酸分子,并使它们在适当的细胞中增殖的遗传操作。这种操作可把特定的基因组合到载体上,并使之在受体细胞中增殖和表达。DNA重组技术被广泛使用,但现在的趋向是仅限于大肽和蛋白的生产,许多生物活性肽,特别是一些有感官效应和营养特性的肽都是短肽,所以在这方面用重组DNA法是很有限的,另一个明显的缺点是世界某些部分的消费者反对使用由遗传改性生物所生产的食品产品[27-28]。
谷朊粉在中性蛋白酶、淀粉酶及糖化酶预处理的基础上,经乳酸菌与酵母菌混合发酵,预处理时间2 h,接种量1.0%,发酵时间28 h,运用此法生产的活性肽具有比原蛋白优越的溶解性能和消化吸收性能,而且活性肽的苦味也得到降低,微生物发酵法解决了谷朊粉水解产品因味苦不能产业化的问题[29]。以小麦面筋蛋白和小麦为原料,采用米曲霉和乳酸菌混合制曲结合发酵技术制备高品质呈味基料,并对其鲜味肽进行了分离纯化和鉴定,经分离纯化得到一个三肽的鲜味肽,其氨基酸序列为Asp-Cys-Gly(DCG)[30]。
刘立芳[31]利用酵母对小麦面筋蛋白酶解液进行发酵,得到具有较强抗氧化功能的小麦多肽酒。随着人们生活水平的提高,对保健酒的需求越来越高,所以小麦多肽酒的市场发展前景乐观。马涛等[32]采用超滤手段纯化低聚肽,通过分子排阻色谱检测其分子量分布,同时对其抗过敏活性进行测定,结果表明,小麦肽对透明质酸酶具有很强的抑制作用,其IC50值为55.24 mg/mL,可以用于开发抗过敏的功能食品。
呈味肽广泛存在于食品中,小麦谷朊粉中谷氨酸/谷氨酰胺含量高,是很好的鲜味肽前体。INDOH K等[33]分别以小麦面筋蛋白和大豆为底物制曲,研究发现以小麦面筋蛋白成曲发酵得到的鱼鲜酱油肽段中富含呈鲜味的游离氨基酸,并且与大豆曲相比其游离氨基酸总含量更高,并具有更优的鲜味和整体的滋味。谷中华等[34]利用中性蛋白酶酶解谷朊粉生产分子质量分布合适的多肽动物饲料添加剂。根据动物饲料的特性及所需的成分进行合理的搭配,提高饲料的营养价值。
另外,很多研究表明小麦蛋白肽具有降血压、抗氧化、阿片活性、抑制血管紧张素转化酶、免疫调节等生理功能,可以作为筛选药物、制备功能性食品及食品添加剂的天然宝贵资源。
我国对小麦蛋白的研究尚处于起步阶段,主要用于食品烘焙行业,产品开发和附加值较高的功能性研究也较少。通过对小麦蛋白肽的研究可以提高小麦深加工中副产品的利用价值,同时也能提高小麦产品的附加值。
目前酶法水解制备小麦蛋白肽所用的酶大多为胃蛋白酶和碱性蛋白酶,为了不增加成本又能使得酶解蛋白技术得到更广泛的应用,应该努力研究和开发出既经济、环保又适用的酶制剂。
小麦蛋白疏水性较强,由于水解作用会使越来越多的疏水性氨基酸暴露出来,具有明显的苦味,从而限制了小麦多肽在食品中的应用。目前虽有很多方法,但效果不是很明显,而且会使得活性肽的质量下降。小麦蛋白肽脱苦机理还有待更深入的研究。
生物活性肽和肽丰富的蛋白质水解物代表一个新的方向在功能性食品和营养保健品。国外对蛋白酶解物和活性肽类产品的研究开发非常活跃,已经发现和分离了很多的生物活性肽。目前已有很多的谷蛋白肽产品出现在国际市场上,而我国对小麦蛋白的研究较少,对于肽类制品的开发研究主要还是集中在大豆蛋白和酪蛋白等品种上。随着我国食品加工业的不断发展以及各种功能性食品的研究开发,小麦生物活性肽的研究具有广阔的前景。
[1]李文彪.干法分离小麦蛋白粉技术[J].粮食与饲料工业,1996(8):5-8.
[2]王叔全.谷朊粉应用概述[J].粮油食品科技,2002,8(2):5-7.
[3]柳小军,刘国琴,李 琳,等.小麦源生物活性肽研究进展及应用[J].农产品加工·学刊,2009(3):81-96.
[4]钟耀广.功能性食品[M].北京:化工工业出版社,2010.
[5]YIN H,CAI H Z,WANG S K,et al.Wheat peptides reduce oxidative stress and inhibit NO production through modulating μ-opioid receptor in a rat NSAID-induced stomach damage model[J].Chinese Journal of Natural Medicines,2015,13(1):22-29.
[6]印 虹,孙桂菊.小麦肽研究进展[J].江苏农业科学,2013,41(9):7-9.
[7]TSOU M J,LIN W T,LU H C,et al.The effect of limited hydrolysis with neutrase and ultrafiltration on the anti-adipogenic activity of soy protein[J].Process Biochem,2010,45(2):217-222.
[8]MOURE A,DOMINGUEZ H,PARAJ J C.Antioxidant properties of ultrafiltration-recovered soy protein fractions from industrial effluents and their hydrolysates[J].Process Biochem,2006,41(2):447-456.
[9]CHIANG W D,TSOU M J,TSAI Z Y,et al.Angiotensin I-converting enzyme inhibitor derived from soy protein hydrolysate and produced by using membrane reactor[J].Food Chem,2006,98(4):725-732.
[10]杨芳伟.浅谈小麦活性肽的提取工艺及影响因素的研究[J].粮食加工,2010,35(6):59-62.
[11]张亚飞,乐国伟,施用晖,等.小麦蛋白Alcalase 水解物免疫活性肽的研究[J].食品与机械,2006,22(3):44-46.
[12]ZHU K X,ZHOU H M,QIAN H F.Antioxidant and free radical-scavenging activities of wheat germ protein hydrolysates(WGPH) prepared with alcalase[J].Process Biochemistry,2006,41:1296-1302.
[13]MATSUI T,LI C H,OSAJIMA Y.Preparation and characterization of novel bioactive peptides responsible for angiotensin I-converting enzyme inhibition from wheat germ[J].J Pept Sci,1999,5(7):289-297.
[14]WADA S,SATO K,OHTA R,et al.Ingestion of low dose pyroglutamyl leucine improves dextran sulfate sodium-induced colitis and intestinal microbiota in mice[J].J Agr Food Chem,2013,61(37):8807-8813.
[15]BARBEAU W E,HONTECILLAS E,HORNE W,et al.Elevated CD8 T cell responses in type 1 diabetes patients to a 13 amino acid coeliac-active peptide from α-gliadin[J].Clin Exp Immunol,2013,175:167-171.
[16]KIM S K,WIJESEKARA I.Devecopment and biological activities of marine-derived bioactive peptides:A review[J].J Funct Food,2010,2(1):1-9.
[17]马洪龙,韩 飞,李爱科,等.碱性蛋白酶水解小麦面筋蛋白制取谷氨酰胺肽的研究[J].粮油食品科技,2014,22(1):54-57.
[18]孔祥珍,华欲飞,张彩猛.酶法水解制备植物蛋白肽粉的研究[J].中国油脂,2013,38(1):16-19.
[19]张锐昌,徐志宏,刘邻渭.酶解谷朊粉制备小麦肽的研究[J].食品研究与开发,2006,27(6):4-7.
[20]YANG F W.Introduction to the extraction process of wheat high immune biological active peptide[J].Mod Flour Ind,2011,(1):40-43.
[21]王 辛,苏从毅,王 猛,等.酶法水解小麦蛋白技术的研究[J].现代面粉工业,2013(1):33-35.
[22]王岁楼,祝红蕾,张 栋.小麦蛋白酶解制备活性多肽的研究[J].食品科学,2008,29(9):388-392.
[23]孙丽平,庄永亮,张 莉,等.酶解小麦蛋白产物-还原糖美拉德反应的光谱研究[J].分析化学,2009,37(9):1359-1362.
[24]SUN J,YIN G Y.Composite enzymatic preparation of wheat gluten protein peptide and its antioxidant activity[J].Foodstuffs Technology,2014,22(2):95-99.
[25]潘丽军,张 丽,钟昔阳,等.双酶分步水解法制备谷氨酰胺活性肽的研[J].食品工业科技,2009,30(5):184-187.
[26]HE R H,XING H,WANG Z P,et al.Establishment of an enzymatic membrane reactor for angiotensin-converting enzyme inhibitory peptides preparation from wheat germ protein isolates[J].J Food Process Eng,2015:1-10.
[27]蒲首丞,王金水.生物活性肽的制备与应用[J].粮食加工,2005(5):49-51.
[28]史延平,孙永梅,王万东.生物活性肽-一个改变了动物氮代谢观念的新领域[J].丹东纺专学报,2002,9(2):1-3.
[29]黄继红,王 娟,杨公明,等.发酵脱除小麦谷朊粉生物活性肽苦味的研究[J].发酵科技通讯,2010,39(2):20-23.
[30]彭睆睆.利用小麦面筋蛋白制备呈味基料及呈味肽的分离鉴定[D].广州:华南理工大学硕士论文,2014.
[31]刘立芳.酶解小麦面筋蛋白及多肽酒发酵研究[D].杨凌:西北农林科技大学硕士论文,2009.
[32]马 涛,林 峰,林 单,等.食源性低聚肽抗过敏活性研究[J].食品科技,2014,39(2):27-30.
[33]INDOH K,NAGATA S,KANZAKI K,et al.Comparison of characteristics of fermented salmon fish sauce using wheat gluten Koji with those using soy sauce Koji[J].Food Sci Technol Res,2006,12(3):206-212.
[34]谷中华,钱海峰,陈思思,等.谷朊粉酶解制备多肽饲料添加剂的研究[J].粮食与饲料工业,2013(4):52-58.