化痰除湿法对早期实验性骨关节炎软骨细胞凋亡的影响

杨雨果，杨金锁

(河南省南阳市南阳医学高等专科学校，河南南阳 473061)

化痰除湿法对早期实验性骨关节炎软骨细胞凋亡的影响

杨雨果，杨金锁

(河南省南阳市南阳医学高等专科学校，河南南阳 473061)

目的:探讨化痰除湿法在早期实验性骨关节炎软骨细胞凋亡的应用研究。方法:选用健康Wistar大鼠40只，体质量为(250±10)g，雌雄各半，按随机数字表法将80只大鼠分为A组化痰除湿法组、B组西药阳性对照组、C组模型组、D组空白对照组每组各20只。所有的大鼠均采用改良Hulth造模法进行造模实验，形成骨性关节炎模型，第4周开始给药，干预4周后取大鼠膝关节软骨光镜观察形态学变化，用原位末端标记法(TUNEL法)、免疫组化法分别观察软骨细胞凋亡情况和增殖细胞核抗原(PCNA)表达情况，以及用放免法测定关节液中IL-1、TNFa的含量。结果:A组的软骨细胞凋亡指数小于模型组，而A组的PCNA表达要高于其他各组，化痰除湿法组大鼠关节液中IL-1、TNFa的含量均较其他组显著升高。结论:化痰除湿法在减少大鼠早期膝关节实验性OA软骨细胞的凋亡有着显著作用，可促进软骨细胞的增殖，对早期骨关节炎有较好的治疗作用。

骨关节炎;软骨细胞;细胞凋亡;化痰除湿法

骨性关节炎(osteoarthrisis，OA)是一种严重慢性进行性骨关节病，主要病变主要集中在关节软骨。患者一旦发病，最主要的临床表现为发展缓慢的以关节疼痛、活动僵硬、关节肿胀畸形、局部压痛明显、活动受限和外观畸形。目前的研究调查发现，劳损、创伤、炎症、代谢或遗传是最易导致骨性关节炎发病的因素。其中中老年人为好发人群，其发病机制尚不明确，疗效也不理想［1-2］。故骨性关节炎的治疗及其机制的研究是基础和临床研究的重点所在。

随着现代医学技术发展，中医药治疗骨性关节炎有一定的独特优势，且对该病的发病机理和药物作用机制的研究有着更深的研究［3］。本研究旨在探讨化痰除湿法对早期实验性骨关节炎软骨细胞凋亡的影响，进一步探讨骨性关节炎发病机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

选用健康Wistar大鼠40只，体质量(250±10) g，雌雄各半，由本院附属医院动物研究所提供。

1.2 实验用药

化痰除湿祛瘀剂组方:制南星12 g，制川乌6 g，薏苡仁、丹参、地龙各10 g，刺五加20 g，水煎浓缩，蒸馏水调药物浓度调至每毫升含生药2.0 g，4℃冰箱保存备用。阳性药物疏酸氨基葡萄糖片0.314 g/片，新兴同仁药业有限公司提供。第一抗体购自美国Zymed公司，TUNEL试剂盒DAMO公司提供，PCNA单克隆抗体购自北京中山生物技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型建立及动物给药 采用氯胺酮按20 mg/kg耳缘静脉注射麻醉，参照Hulth造模型方法，A、B组于无菌条件下切断其左膝内侧副韧带及切除内侧半月板以及前交叉韧带;C组仅作左膝关节内侧皮肤切开后缝合，D组不作任何手术处理。术后分笼饲养，且每天肌注青霉素2×104U/ kg，共3 d。4周后根据Meeh-Rubner公式计算兔的给药，A、B 2组均给予化痰除湿祛瘀剂(4 g生药量/ kg体质量)，C、D组给予生理盐水25 mL，每天灌胃1次，连续4周［4］。

1.3.2 取材 干预4周后处死大鼠(处死前抽取关节液进行放射免疫法检测相关因子)，切取患侧胫骨全层关节软骨及滑膜，立即放入戊二醛中固定并进行电镜检查，部分软骨和内侧胫骨平台的软骨切下后放入10% 的甲醛溶液中固定，以便用于PCNA测试。

1.4 检测方法

1.4.1 凋亡软骨细胞检测 采用TUNEL检测方法，按照参考文献［5］的实验步骤进行凋亡软骨细胞检测、细胞凋亡指数(AI)和细胞增殖指数(PI)判定。AI=TUNEL标记阳性细胞数/软骨细胞数× 100%;PI=PCNA标记阳性细胞数/软骨细胞数× 100%。

1.4.2 免疫组化 冰箱中取出眼组织冰冻切片室温放置30 min;纯丙酮室温固定20～30 min，蒸馏水洗5 min×3次;纯甲醇加H2O2至0.5%，室温浸泡30 min，以灭活内源性过氧化物酶。蒸馏水洗5 min×3次;滴加正常山羊血清封闭液，室温20 min。甩去多余液体，不洗;滴加抗体稀释液稀释的1∶100的大鼠抗体，置湿盒20℃孵育20 min，PBS冲洗2 min×3次;滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，37℃20 min。PBS冲洗2 min×3次;滴加试剂SABC，37℃20 min。PBS冲洗2 min×3次;DAB显色:取配制好的DAB液加之切片，室温避光显色(控制反应时间在10 min)，蒸馏水洗涤10 min，苏木素轻度复染、脱水、透明封片，显微镜下观察［6］。

1.5 统计学方法

采用图像分析仪(Image-Pro Plus 6.0)进行图像分析，根据免疫组化阳性的强弱测定其IOD值。所有测量数据均采用SPSS 17.0软件统计分析，计量资料以均值±标准差(±s)表示，计数资料采用χ2检验，组间进行采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组光镜下观察关节软骨形态学改变

化痰除湿法组部分软骨剥脱，软骨表面有少许浅裂隙，软骨细胞排列较整齐呈柱状，表面出现少许空隙窝，部分软骨细胞增大，钙化层软骨细胞轻度成簇(图A);阳性药物对照组软骨表面不甚光滑，结构尚清晰，形成钙化层，骨小梁数目增多(图B);模型组软骨表面变薄出现多个裂隙，部分软骨剥脱缺损，表面出现多个空隙窝，可见较多裂隙从表层软骨延伸向下深达放射层，部分软骨细胞核固缩、坏死并偏向一侧，化层软骨细胞出现簇积现象，排列紊乱(图B);空白对照组软骨表面光滑，呈柱状排列(图D)。

注:A.化痰除湿法组(×400);B.阳性药物对照组(×400);C.模型组(×400);D.空白对照组(×400)

2.2 各组TUNEL观察和细胞凋亡指数AI统计结果

表1图1显示，采用TUNEL方法检测凋亡细胞核呈棕黄色，主要位于软骨浅层，各层分布明显，各组间AI比较差异有统计学意义(F=14.36，P＜0.05)。

表1 各组大鼠细胞凋亡指数(AI)结果比较

2.3 各组软骨细胞PCNA免疫组化的观察和增殖指数(PI)结果

注:A.模型组TUNEL(×40);B.化痰除湿组PCNA表达(×40)

图1表2显示，各组经免疫组化实验发现，化痰除湿组表层和中层PCNA染色体阳性细胞较多，而模型组软骨浅表层PCNA阳性细胞较多，并可见呈巢样增生的软骨细胞，主要位于软骨中层，染色大多呈阳性。

表2 各组增殖指数(PI)结果

2.4 各组关节液中IL-1及TNFa含量比较

表3显示，化痰除湿法组大鼠关节液中IL-1、TNFa的含量均较对照组显著升高(P＜0.05)。

表3 各组关节液中IL-1及TNFa含量比较(pg/mL)

3 讨论

骨性关节炎又称退行性关节病、骨质增生、骨关节病，是一种慢性进行性骨关节疾病，好发于老年。据流行病学资料统计显示［7］，其发病率呈逐年增加趋势，目前美、英国家患有膝关节炎的比例为5%～10%，与心血管和创伤疾病位列前三位，故了解骨关节炎的病因及发病机制，是目前研究的热点和重点。

中医学研究显示［8-9］，骨关节炎是痹症中的一种特殊类型，但与风寒湿痹不尽相同，其致病机制复杂，既有人体自然衰老所致的肝肾亏损、气血两虚等生理因素，又有外感风寒湿邪、慢性损伤等因素。目前研究显示，“化痰消瘀”为治痹的关键，痰瘀兼驱方可奏效，祛痰可助化瘀。

现代药理学研究显示［10］，制南星、制川乌、薏苡仁、刺五加、丹参、地龙等联合组方可促进微循环，降低血液黏稠度和血小板及红血球凝集性，溶解血栓而改善血液流变学，从而改善微循环，降低骨内压力，恢复骨关节供血，有利于骨关节的修复。

本组研究建立实验性骨关节炎模型，采用化瘀除湿法进行干预，结果发现化瘀除湿法组软骨细胞凋亡指数小于模型组(P＜0.05);而化瘀除湿法组的增殖细胞核抗原(PCNA)表达要高于其他各组(P＜0.05)。

目前研究报道称［11］，关节滑膜细胞及软骨细胞自身在受到不同损伤或炎症时可产生大量细胞因子，这些因子加速了骨性关节炎的发生。本组研究对各组大鼠干预后关节液中的IL-1和TNFa水平进行检测，结果发现化痰除湿法组大鼠关节液中IL-1、TNFa的含量均较对照组显著升高(P＜0.05)，说明祛痰除湿法可能通过影响膝关节软骨中IL-1、TNF-a的表达，从而减轻炎症反应，延缓关节软骨细胞的退变。

综上所述，化痰除湿法显著减少兔早期膝关节实验性OA软骨细胞的凋亡，促进软骨细胞的增殖，对早期骨关节炎有较好的治疗作用。

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［4］翟吉良，翁习生，邱贵兴.骨关节炎动物模型的建立及选择［J］.中国矫形外科杂志，2007，15(11):843-845.

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Effect of Removing Phlegm and Dampness Method on Apoptosis of Chondrocytes in Early Experimental Osteoarthritis

YANG Yu-guo1，YANG Jin-suo2
(Nanyang Medical High College，Henan Province，Nanyang 473061，China)

Objective:To study the Huatan Chushi Quyu preparation on cartilage cells apoptosis in Experimental with osteoarthritis.Methods:Selected 40 healthy Wistar rats，weighing(250±10)g，male and female，according to figures random method 80 rats were divided into Group A Huatan Chusi method in group B as positive control group，group C as a model group，D group was the blank control group in each group 20.All rats were using modified Hulth modeling method modeling experiments，the formation of osteoarthritis model，the first 4 weeks of administration，four weeks after the intervention from rat knee cartilage morphology was observed by light microscopy，in situ end labeling(TUNEL method)，immunohistochemical staining were observed chondrocyte apoptosis and the expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA)，and measured by radioimmunoassay synovial fluid IL-1，TNFa levels.Results:Chondrocyte apoptosis index of Hatan Chushi method group is smaller than the model group;while PCNA expression in Hutan Chushi method group than the other groups;synovial fluid of rats in Hutan Chushi method group IL-1，TNFa levels were significantly higher than the other groups.Conclusions:Huatan Chushi method significantly reduces OA chondrocytes apoptosis in Rat knee in early stage，promote the proliferation of chondrocytes，have a better therapeutic effect early osteoarthritis.

Osteoa is higher rthritis;chondrocytes;apoptosis;Hantan Chushi Method

R684.3

B

1006-3250(2015)06-0665-03

2015-03-05

杨雨果(1979-)，男，医学硕士，从事中医骨伤学的临床与研究。