红花中羟基红花黄色素A的提取工艺

肖艳华，李艳艳，崔猛，龚焕

武汉工程大学化工与制药学院，湖北 武汉 430074

红花中羟基红花黄色素A的提取工艺

肖艳华，李艳艳，崔猛，龚焕

武汉工程大学化工与制药学院，湖北 武汉 430074

采用单因素实验和4因素3水平正交实验，利用面积归一法，以高效液相检测羟基红花黄色素A的含量为指标，考察了羟基红花黄色素A提取工艺的影响因素，确定了最佳的溶剂浓度、溶剂用量、提取温度和超声时间.结果表明超声提取时间对羟基红花黄色素A提取的影响最为显著，影响因素的主次顺序为:超声时间＞乙醇浓度＞提取温度＞溶剂用量.最佳单因素为:70%的乙醇质量浓度、50℃的提取温度、体积比为15的溶剂用量、15 min的超声时间；最佳提取工艺为:在50℃下，加入10倍量的质量分数70%乙醇，超声提取20 min，固定提取次数为一次，此时羟基红花黄色素A的提取含量最高.

羟基红花黄色素A；正交实验；超声；提取工艺

0 引言

红花（Safflower carthamus）为菊科植物的干燥管状花.具有活血通经，祛瘀止痛之功效，其药花性湿、味辛微苦.红花中含有红色素和黄色素两种色素［1］，其中羟基红花黄色素A（HSYA）为红花黄色素中药效最好，而且含量最多的一种查尔酮苷类化合物，是红花中最有效的水溶性成分［2］.研究表明，HSYA结构如图1，可有效抑制血小板激活因子的诱发血小板聚集和释放，可竞争性地抑制血小板激活因子与血小板受体的结合［3-8］，此外还用于保健品和化妆品中［9］.本实验利用正交设计，采用L9（34）正交表以HSYA的含量为标准进行实验，探讨了HSYA的最佳提取条件，为红花制剂的质量控制标准提供了科学依据.

图1 羟基红花黄色素A的结构Fig.1 The structure of hydroxy safflower yellow A

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

KQ5200B超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），JY5002电子天平（南京远拓科学仪器有限公司），DHG-9143B5-Ⅲ电热恒温鼓风干燥箱（上海新苗医疗器械有限公司），DIONEX，P680 HPLC Pump高效液相色谱仪（戴安公司），ZF-20D紫外可见分光光度计（巩义予华仪器有限责任公司）.

所用药材红花样品由湖北襄阳隆中药业基团有限公司提供，经隆中药业肖作武总工鉴定，并保存于武汉工程大学化工与制药学院制药工程部实验楼706室.实验所用水为蒸馏水，高效液相所用试剂为色谱级，其它均为分析级.

1.2 质谱条件

鞘气:45 unit／min，喷雾电压:4．5 kV，加热毛细管温度:300℃，扫描方式:正离子扫描和负离子扫描，扫描质量范围:50～2 000.

LC-MS分析结果:HSYA的液相色谱条件（面积归一法）:甲醇:质量分数1．0%乙酸缓冲液＝3∶7，流速:1．0 mL·min-1，检测波长:320 nm，柱温:20℃，保留时间:t＝5．64 min.

1.3 红花水提液的制备

精确称量红花药材5g，按料液比100 mL·g-1加入蒸馏水，置于超声容器中60 min，静置12 h，过滤浓缩定容至50 mL，取2 mL再稀释至50 mL作为分析用样品.

1.4 方法学考察

1.4.1 精密度试验取步骤1．3中供试液按1．2的色谱条件连续进样6次，测得t＝5．64 min对应峰相对保留时间的RSD≤0．41%，相对峰面积RSD≤4．6%，可见仪器精密度良好.

1.4.2 重复性试验精密称取5 g样品6份，按1．3的方法制得供试液，按1．2的色谱条件进样测得t＝5．64 min对应峰相对保留时间的RSD≤0．35%，相对峰面积RSD≤3．4%，可见该方法重现性良好.

1.4.3 稳定性试验取1．3供试液，分别在0、2、4、8、12、16 h按1．2的色谱条件进样，可测得t＝5．64 min对应峰相对保留时间RSD≤0．46%，相对峰面积RSD≤1．9%，说明样品在16 h内稳定.

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 乙醇质量浓度的影响固定提取次数为一次，准确称量2 g红花药材5等份，分别加入10倍（v／v）量的水，质量分数10%、40%、70%、95%乙醇，室温条件下浸提60 min，抽滤、浓缩后加水定容至100mL，不同浓度乙醇提取后HSYA的含量分析结果见图2.

图2 不同乙醇质量分数对HSYA质量分数的影响Fig.2 Effect of different concentrations of ethanol on the content of HSYA

由图2可知，当乙醇质量分数达到70%，HSYA的提取已趋平衡.这个结果与HSYA的结构是相关的:HSYA是一个含有两个单糖的双糖查尔酮苷，结构中的12个羟基使该物质有一定的亲水性，所以在查尔酮母核和糖的共同作用之下，HSYA既有一定的亲水性，也有一定的亲脂性，实验表明，当乙醇质量分数为70%时，对HSYA的溶解度达到最高.

2.1.2 提取温度的影响准确称量2 g红花药材5等份，加入10倍（v／v）量的质量分数70%乙醇，提取时间为60 min，提取的温度分别为20、30、40、50、60℃，抽滤、浓缩后加水定容至100 mL.不同温度提取时HSYA的质量分数分析结果见图3.

图3 不同提取温度对HSYA质量分数的影响Fig.3 Effect of different extraction temperature on the content of HSYA

由图3得，根据溶解原理，温度高溶解度会增大，所以当提取温度从20℃升至50℃时，HSYA的质量分数是越来越高，当温度在50℃时达到最高.但是如果继续提高提取温度到60℃，发现其质量分数反而降低，这是因为HSYA结构中含有酚羟基、双键和苷键等易于氧化、水合和水解的官能团，温度持续的升高加大了HSYA形成醌、次生苷以及苷元的可能，使其含量急剧下降.通过此单因素实验确定其最佳提取温度是50℃.

2.1.3 溶剂用量的影响准确称量2 g红花药材5等份，分别加入5、10、15、20、25倍（v／v）量的质量分数为70%乙醇，50℃下浸提60 min，抽滤、浓缩后加水定容至100 mL，不同溶剂用量提取后HSYA的质量分数分析结果见图4.

图4 不同溶剂用量对HSYA质量分数的影响Fig.4 Effect of different amounts of solvent on the content of HSYA

由图4可得，随着溶剂用量的增加，HSYA的质量分数相应增大，说明增大溶剂用量有利于HSYA的充分提取.但是当红花药材和溶剂体积比到15、20和25倍时，HSYA的质量分数基本成了一条直线，继续增加溶剂的用量，HSYA质量分数并没有增加，说明体积比为15时提取已趋于完全，更多的提取溶剂只会增加后处理中蒸发溶剂的成本.

2.1.4 超声提取时间的影响准确称量2g红花药材5等份，加入15倍（v／v）量的质量分数为70%乙醇，室温条件下分别超声提取0、5、10、15、20min，再依次静置浸提60、55、50、45、40 min，抽滤、浓缩后加水定容至100 mL.不同超声时间提取后，分析HSYA的质量分数，结果见图5.

由图5可得，超声提取15 min，HSYA质量分数达到最高，延长超声时间HSYA含量下降，超声虽能在空化效应的作用下使得植物细胞壁及整个生物体破裂，有利于有效成分的溶出，但长时间的空化效应不仅会使植物破裂，也会引入更多的杂质同时也使温度升高，而高温高压都有可能加速查尔酮苷的水解最终使得HSYA的质量分数下降.

图5 不同超声时间对HSYA质量分数的影响Fig.5 Effect of different ultrasonic time on the content of HSYA

表1 L9(34)正交试验的因素和水平Table 1 The factor and levels of orthogonal design

表2 正交试验设计和结果Table 2 The orthogonal design and results

通过以上单因素实验发现用15倍的质量分数为70%乙醇在50℃超声提取15min，HSYA的质量分数达到最高.

2.2 正交实验

通过上述单因素实验结果，可以确定固定提取次数为一次的情况下，乙醇质量分数、溶剂用量、提取温度及超声时间对HSYA的提取有显著影响.选择乙醇质量分数（A）、溶剂量（B）、提取温度（C）、超声时间（D）四个因素考察，每因素各取3个水平，结合红花药材处理及对HSYA纯化尝试的实验经验，安排L9（34）正交试验表1.

3 结语

首先本实验采用单因素实验法，找出提取的最佳单因素点分别是:质量分数为70%的乙醇为最佳比例；50℃为提取最佳温度；溶剂用量体积比为15时最佳；15 min为超声最适时间.

然后以乙醇质量分数、溶剂用量、提取温度、超声时间为因素设计正交实验，分析正交试验结果可知，超声提取对HSYA的提取影响最为显著，影响因素的主次顺序为超声时间＞乙醇质量分数＞提取温度＞溶剂用量.以高效液相检测HSYA的质量分数为指标，超声时间对HSYA的提取有显著影响，超声时间控制在一定范围内，可充分提取HSYA；乙醇质量分数对HSYA的影响次之，保持一定质量分数的乙醇，可以使HSYA完全溶解，保持HSYA的提取质量分数较高；严格控制温度，不仅可以提高HSYA的质量分数，还可以降低HSYA因受热水解变性的可能性；溶剂量的影响较小，在保证红花药材充分浸泡的前提下，可以适当减少溶剂用量，这样不仅降低了后处理的工作负荷，还降低了成本.本实验最终确定HSYA的最佳提取工艺为A2B1C2D3，即50℃下，加入10倍量的质量分数70%乙醇超声提取20 min效果最佳.

致谢

感谢武汉工程大学化工与制药学院提供的试验平台，感谢本实验室其他成员的帮助！

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Extraction process of hydroxy safflower yellow A in Safflower carthamus

XIAO Yan-hua，LI Yan-yan，CUI Meng，GONG Huan
School of Chemical Engineering＆Pharmacy，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430074，China

According to the content of hydroxy safflower yellow A（HSYA）by high performance liquid chromatography，single factor experiments and orthogonal experiments（four factors three levels）were conducted to determine the optimal factors on the extraction of HSYA，such as the concentration of solvent，the amount of solvent，extraction temperature and extraction time．The results show that the ultrasonic extraction time is the most important factor and the order of the influential factors are ultrasonic extraction time〉ethanol concentration〉extraction temperature〉solvent consumption．The conditions for the best single factor experiment are 70%ethanol concentration，15 times of the volume ratio of solvent and ultrasonic extract for 15 minutes under 50℃．The best extraction factor for the highest content of HSYA is adding 10 times of 70%ethanol extract only once for 20 minutes under 50℃with ultrasonic．

hydroxy safflower yellow A；orthogonal experiment；ultrasonic；extraction process

TB35

A

10.3969/j.issn.1674-2869.2015.03.004

1674-2869（2015）03-0015-05

本文编辑：张瑞

2015-01-08

肖艳华（1971-），女，湖北武汉人，副教授，博士.研究方向:药物合成及天然产物的提取分离与活性研究.