水产疫苗研究开发现状与趋势分析

王忠良王蓓鲁义善吴灶和

（1.广东海洋大学水产学院，湛江 524088；2.仲恺农业工程学院，广州 510225）

水产疫苗研究开发现状与趋势分析

王忠良1王蓓1鲁义善1吴灶和2

（1.广东海洋大学水产学院，湛江 524088；2.仲恺农业工程学院，广州 510225）

水产疫苗不仅能够增强水产动物的免疫力，预防水产病害发生，还能减少各类药物的使用，降低生殖生产成本，解决各种药物残留带来的食品安全和环境污染等问题，使水产养殖业向绿色、可持续方向发展。因此，水产疫苗已成为水产动物病害防治领域的研究热点。综述了水产疫苗的发展历程、水产疫苗种类与接种方式，并介绍了水产疫苗关键技术发展现状与趋势。

水产疫苗；种类；接种方式；现状与趋势

在人们对水产品质量安全和环境污染问题日益关注的今天，采用各种化学药物防治水产养殖动物病害的方式越来越多地受到质疑。疫苗不仅能提高水产养殖动物机体的特异性免疫水平、有效预防疫病发生，且符合不污染环境、水产品无药物残留的要求，因此，疫苗已成为水生动物疾病防治领域研究与开发的主流产品，而接种疫苗也已成为国际现代水产养殖业的规范性生产标准。目前，针对鲑鳟鱼类、欧洲鲈鱼（Perca fluviatilis）、大西洋鳕鱼（Gadus morhua）等国际上主要水产养殖品种均已开发出相应的商品化疫苗，并已成为国外以鲑鳟鱼类为代表的重要经济鱼类养殖业成功的关键因素之一。在我国，水产疫苗的开发与应用步履蹒跚，与世界第一水产养殖大国的称号极不相称，更与水产养殖强国的发展目标相距甚远。为此，本文综述了水产疫苗的发展历程、种类与接种方式，并介绍了水产疫苗关键技术发展现状与趋势，以期为我国水产疫苗开发与应用提供参考。

1 水产疫苗的发展历程

水产疫苗的研究工作始于20世纪40年代。加拿大学者Duff［1］首次将灭活的鲑鱼产气单胞菌口服免疫应用于鳟鱼（Salmo gairdneri）获得成功，开创了水产疫苗的新纪元。20世纪70年代，北欧和北美鲑鱼工业化养殖初期日益严重的病害促进了欧美等国积极开展水产疫苗的研制，由荷兰Intervet公司率先推出的首例防治鲑鱼弧菌病（Vibriosis）和肠型红嘴病（Enteric redmouth disease）的福尔马林细菌性灭活疫苗在北美鲑鱼养殖生产中取得了巨大的商业成功，开启了世界水产疫苗的商业化进程［2］。1988年，挪威法玛克公司开发出抗冷水弧菌病的细菌灭活疫苗，并因此拯救了挪威的三文鱼（Oncorhynchus keta）养殖产业。此后，世界首例疖点病细菌灭活鱼疫苗、世界首例传染性鲑鱼贫血病（Infectious salmon anaemia，ISA）病毒疫苗和传染性造血坏死（Infectious haematopoietic necrosis，IHN）病毒病疫苗相继开发，使得欧洲的鲑鱼养殖业的重大传染性病害得到有效控制，并显著减少了抗生素在水产养殖中的使用［2］。进入21世纪后，随着基因工程技术的发展和人们对疫苗安全性认知的深入，以基因工程疫苗为主要特征的水产疫苗陆续被商业许可，如荷兰英特威公司开发的鲶鱼肠败血病减毒活菌疫苗和鲶鱼柱形病减毒活疫苗等。至2012年，据不完全统计，全球商业化生产的水产疫苗已超过140种［3］。

我国水产疫苗研究起步较晚，始于20世纪70年代［4］。早期研究的草鱼出血病组织浆灭活疫苗（即土法疫苗）取得了一定的效果，从此拉开了我国水产疫苗研制的序幕［5］。1986年，通过草鱼肾细胞（CIK）培养的草鱼出血病病毒灭活疫苗取得了较好的免疫效果和较高的中和抗体效价，此后对草鱼细菌性疫苗，如斑点气单胞菌苗、草鱼烂鳃病菌苗、肠炎菌苗等的研制也取得了较大的成果［5，6］。20世纪90年代初，对中华鳖嗜水气单胞菌灭活菌苗以及海水鲈鱼鳗弧菌口服微胶囊疫苗的研制进一步推动了我国渔用疫苗研制的进程［7，8］。近年来，随着分子生物学、基因工程等学科的发展和国家科技投入的增加，我国水产疫苗研究掀开了崭新的一页，迈出了新的步伐。据统计，全国现有近30家科研单位开展水产疫苗相关研究，涉及包括病毒、细菌和寄生虫等病原27种（类）［3］。到目前为止，有4个疫苗获得国家新兽药证书，分别为草鱼出血病细胞灭活疫苗、鱼用嗜水气单胞菌灭活疫苗和牙鲆溶藻弧菌、鳗弧菌、迟缓爱德华菌病多联抗独特型抗体疫苗以及草鱼出血病活疫苗；2011年初草鱼出血病活疫苗生产使用的批准（农业部公告1525号）正式开启了我国水产疫苗产业化进程。

2 水产疫苗的种类

水产疫苗按抗病原的种类可分为细菌疫苗、病毒疫苗和寄生虫疫苗；按组成成分可分为单价疫苗、多价疫苗和混合疫苗（多联疫苗）；按疫苗制备方式可分为活疫苗、灭活疫苗（包含土法疫苗）、亚单位疫苗及生物技术疫苗等。

2.1 活疫苗

在兽医临床中有强毒苗、弱毒苗和异源苗3种，目前水产活疫苗中应用较多的是用致病性已大为减弱的病毒减毒株或变异的弱毒株制备的疫苗，称为弱毒疫苗，包括VHSV的F25（2 1）抗热株苗、CCV减毒疫苗、疖疮减毒疫苗、IHNV减毒疫苗和草鱼出血症细胞培养的弱毒疫苗［9，10］。弱毒疫苗接种后接近于自然感染，能够有效激发鱼体细胞免疫，并能在体内繁殖，因而疫苗用量少，免疫持续时间较长，且不必添加佐剂。但其不足之处主要是活疫苗在自然条件下安全性差，可能会导致病毒的转变而在生态环境中失去控制；同时，活疫苗贮存运输不方便，且保存期短。

2.2 灭活疫苗

灭活疫苗是经理化方法将病原微生物灭活，但其仍保持免疫原性，接种后使水生动物产生特异性抵抗力的疫苗。灭活疫苗研制周期短，使用安全，易于保存，但其接种后不能在体内繁殖，因此需要接种剂量较大，免疫持续时间短，且需要加入适当的佐剂以增强免疫效果。

此类疫苗包含多种组织浆灭活疫苗、弧菌灭活苗、嗜水气单胞菌疫苗、链球菌疫苗，以及欧美国家鲑鳟鱼养殖中常用的冷水病疫苗、VHS疫苗、PHV疫苗等。

2.3 亚单位疫苗

亚单位疫苗是去除病原体中与激发机体保护性免疫无关甚至有害的成分，但保留有效免疫原成分制作的疫苗。亚单位疫苗较全病毒疫苗除去了产生不良反应的物质，副作用减少。目前，水产上研究较多的是建立在细菌外膜蛋白、脂多糖等保护性抗原免疫原性成分基础上的亚单位疫苗制备，但大部分还在试验阶段，没有商业化生产。如利用细胞肿大虹彩病毒（Red sea bream iridovirus，RSIV）衣壳蛋白351R基因转化大肠杆菌，经灭活处理后注射真鲷（Pagrosomus major）可对RSIV感染产生很好的免疫保护作用［11］。

亚单位疫苗以直接被合成或通过重组DNA技术生产，不含有病原的毒力因子，并且由基因工程菌表达，安全性好，生产简单易控；使用时通常需添加佐剂，或与载体偶联，以增强其免疫保护性。

2.4 基因工程疫苗

基因工程疫苗指应用重组DNA技术，将病原的保护性抗原基因在细菌、酵母或细胞等基因表达系统中体外表达，生产能诱导机体产生保护性免疫反应的病原蛋白质，再经过分离纯化而制备的疫苗。应用基因工程技术能制备不含感染性物质的亚单位疫苗、稳定的减毒疫苗以及多价疫苗，其兼具亚单位疫苗的安全性和活疫苗的免疫效力。

目前，水产养殖上在研究应用的基因工程疫苗有IHNV、IPNV、FRV、鳗鱼病毒和文蛤病毒等疫苗，其中传染性胰脏坏死病毒（infectious pancreatic necrosis virus，IPNV）VP2重组亚单位疫苗是目前唯一商品化的鱼用重组蛋白疫苗［9］。

2.5 DNA疫苗

DNA疫苗是将编码某种蛋白质抗原的重组真核表达载体直接注射到动物体内，被宿主细胞摄取后并转录和翻译表达抗原蛋白，诱导机体产生非特异性和特异性免疫应答，从而起到免疫保护作用。DNA疫苗有别于其他疫苗之处在于它利用载体持续表达抗原，而不是直接使用抗原。与传统疫苗相比，DNA疫苗具有可诱导更全面的免疫反应、稳定性更高、生产成本低、易于大规模生产等优点，且既具有减毒疫苗的优点，又无返毒的危险，被看作是继传统疫苗及基因工程亚单位疫苗之后的第三代疫苗，已成为水产疫苗研究和开发的热点。

有关水产DNA疫苗的研究，最早见于1996年Anderson 等和Gomdz-Chiari 等［12，13］的实验研究。虽然DNA 疫苗的研究工作起步较晚，但已取得了令人鼓舞的成就［14］。目前DNA疫苗主要集中在鲑鳟鱼类IHNV、VHSV、杆状病毒（SVCV）、鲤春病毒（SHRV）等传染性病毒病的防治上，而挪威已批准使用一种可注射的、用病毒蛋白VP3 制作的抗IPN疫苗。

3 水产疫苗的接种方式

现阶段，水产疫苗的接种主要有注射、口服、浸泡（或喷雾）3种方式。每种接种方式在疫病预防的实用性和成本与效益方面各有利弊，而开发疫苗的高效、合理的接种方式一直是水产疫苗研究的重要内容。

3.1 注射法

国内外水产疫苗以注射接种免疫为主。根据注射接种部位的不同可分为皮下注射、肌肉注射和腹腔（胸腔）注射3种，其中腹腔（胸腔）注射接种是疫苗接种的最常用方法。注射免疫能有效刺激机体产生相应抗体，具有用量少、抗体滴度高、免疫持续时间长等特点，但只适合较大规格个体，易引起机体的应激反应，而且费时费力。目前，国外已开发出专门的机器用于注射免疫，但国内尚未见相关报道。

3.2 浸泡（喷雾）法

继Amend等［15］首次采用浸泡法进行鱼类疫苗的免疫接种并获得成功后，弧菌疫苗在大马哈鱼、日本鳗鲡和虹鳟的浸泡免疫中均获得了成功。浸泡（喷雾）免疫方法操作简单，适用于鱼苗的大规模接种，且应激作用小。但直到目前为止，浸泡免疫中疫苗进入机体的路径及作用机制尚不清晰，如疫苗是通过皮肤、鳃、侧线还是其他部位进入机体、疫苗诱导的免疫是通过血液循环系统还是黏膜系统起作用等。此外，多种因素影响机体对浸泡免疫抗原的摄取，包括疫苗浓度、浸泡时间、水生动物大小、佐剂、抗原形态及水温等［16，17］。

3.3 口服法

疫苗的口服免疫不受水产动物大小的限制，对其无任何应激作用，且方便、省时、省力。与其他免疫接种方法相比，口服法免疫更适合大规模养殖或分散养殖水产动物的免疫，尤其适合于多次重复免疫操作。

然而，口服疫苗在实际应用中易受胃肠道消化酶的消化，破坏其免疫原性。因此，目前有关口服疫苗的研究主要集中在探索一种有效的载体投递系统，避免疫苗受消化酶及酸环境的影响。如采用海藻酸盐、PLGA、PELA等可降解生物高分子材料包裹全菌疫苗等研究取得了良好的免疫效果；致力于建立一种能在饲料和水生动物胃肠道中保持疫苗抗原稳定性系统的口服微球缓释疫苗研究也已取得重要进展。

4 水产疫苗关键技术发展现状与趋势

4.1 水产疫苗制备技术

自1942年杀鲑气单胞菌灭活疫苗问世以来，目前世界上商品化的水产疫苗仍以灭活疫苗为主，而通过理化方法将强毒野生型病原灭活仍是疫苗制备的主要技术。随着分子生物学技术的发展进步，水产疫苗的研制有了更多的技术手段，如重组亚单位制备技术、基因缺失减毒技术、基因工程活载体技术和DNA疫苗制备技术等。应用分子生物学技术制备的疫苗具有诸多优点：化学性质更为确定，免疫特性稳定；化学结构可知，可以进行工程设计和改造以激发特定的免疫反应；除去感染成分，不存在残余毒性或毒性回复的隐患；可直接合成或通过重组DNA技术生产，便于工厂化生产，且可以朝多价疫苗研制方向发展。20多年来，水产疫苗基因工程制备技术发展迅速，但依然存在诸如疫苗安全、作用机理不清晰等问题和不足之处，随着免疫学和基因工程技术的研究深入，这将是水产疫苗制备技术的重要发展方向和研究热点。

4.2 水产疫苗佐剂的应用

疫苗佐剂是指与抗原同时或预先应用，能增强机体针对抗原的免疫应答能力，或改变免疫反应类型的物质。佐剂在增加疫苗抗原的表面积，延长其在体内的存留时间，增强巨噬细胞和免疫相关细胞的活性，提高细胞介导的致敏反应能力，加快抗体产生和提高抗体水平等方面均起到了重要作用。

佐剂是伴随着疫苗的研制而被发现和发展的，而最早、最广泛应用于商品化疫苗的佐剂是矿物油佐剂和矿物盐佐剂［3］。20世纪80年代以来，生物来源的佐剂得到了较好发展，如植物来源佐剂、细菌来源佐剂（脂多糖、霍乱毒素、鞭毛蛋白等）、细胞因子佐剂和核酸佐剂等［18-22］。20世纪90年代，随着纳米技术和材料的发展，纳米微球佐剂研究取得了飞速发展，其具有副作用少、缓释、长效、避免胃肠道消化水解等优点［23-25］。近年来，壳聚糖、海藻酸钠微球佐剂制备工艺日趋成熟，并得到了较好的应用。

基于疫苗佐剂在疫苗免疫中的重要作用，新型疫苗佐剂的开发和应用将是水产疫苗研究的重要课题，其重点研究方向包括：新型疫苗佐剂的开发与效果探讨；疫苗佐剂的作用机理；合适疫苗佐剂的选择；疫苗佐剂安全性及其评价方法等。

4.3 水产疫苗免疫基础理论研究

水产动物基础免疫学研究的不完善，加之水产动物跨越的物种范围大、种类多；同时，疫苗的免疫时机、免疫方式、免疫次数和加强免疫的时间等免疫机理还缺乏大量的实验数据和资料支持。以上因素均严重制约了水产疫苗的研制和应用。因此，加强水产疫苗学基础理论研究尤为重要。开展水产动物的免疫系统及其功能、抗原分子诱导水产动物机体产生反应的过程和免疫应答规律、病原体结构、功能、生物学性质、水产疫苗设计、制作的技术基础及方法学、渔用疫苗的免疫效果与环境、机体之间的关系等研究将是水产疫苗研究的又一重要方向。

5 结语

综上所述，水产疫苗的研究开发工作正在全世界范围内蓬勃发展，随着生物技术的不断进步，水产疫苗的使用也呈快速发展势头，并将有效解决因化学药物滥用而导致的水产品质量安全和环境污染问题。在我国，水产疫苗的研制是个新兴产业，面临的问题依然很多，但是，充分利用水产动物免疫防御系统机能，开发出高效、实用及多样化的水产疫苗，是今后水产养殖动物病害防治的必由之路。未来，我国疫苗研发工作应紧跟国际前沿，结合现阶段的基础，面向水产养殖生产实际，从多方面开展相关技术研究，促进我国水产养殖的健康和可持续发展。

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（责任编辑 狄艳红）

Development Status and Trend Analysis in Aquaculture Vaccines

Wang Zhongliang1Wang Bei1Lu Yishan1Wu Zaohe2
（1. Fishery College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088；2. Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225）

Aquaculture vaccines not only boost immunity of aquatic animals and prevent aquaculture diseases， but also reduce the use of drugs， lower the cost of aquaculture reproduction and solve problems of food safety and environment pollutions caused by drug residues， and finally lead aquaculture to develop in the green and sustainable direction. As thus， aquaculture vaccines become one of the research hotspots in the diseases control for aquatic animals. In this paper， the history of vaccine development， vaccine types， and vaccine delivery methods are summarized. The status and trend of key technologies in aquaculture vaccines are introduced.

aquaculture vaccines；vaccine types；delivery methods；status and trend

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.008

2014-11-26

国家自然科学基金项目（31202023），国家海洋局公益性行业科研专项（201205028-2），广东海洋大学优秀青年骨干教师特别资助计划（2014001）

王忠良，男，博士研究生，讲师，研究方向：水产动物生物学；E-mail：leong2006@126.com

吴灶和，教授，博士生导师，研究方向：水产动物病害防治；E-mail：wuzaohe@163.com