植物ICE1-CBF冷反应通路的激活与调控研究进展

魏俊燕赵佳赵仕琪周棋赢袁正仿李先文

（1.信阳师范学院生命科学学院，信阳 464000；2. 信阳师范学院华锐学院，信阳 464000）

植物ICE1-CBF冷反应通路的激活与调控研究进展

魏俊燕1赵佳2赵仕琪1周棋赢1袁正仿1李先文1

（1.信阳师范学院生命科学学院，信阳 464000；2. 信阳师范学院华锐学院，信阳 464000）

植物细胞可能是通过细胞膜流动性的改变引起胞质Ca2+浓度变化来感受低温信号的。胞质Ca2+浓度升高引起胞内多种钙调节蛋白的活性变化，再经过级联反应激活冷反应基因，增强植物的抗低温能力。目前，已基本清楚，冷反应基因激活的一条主要途径是ICE1-CBF调节通路。概括介绍了近年来植物低温信号感受、转导、冷反应基因的表达激活和调节方面的研究概况，旨在为植物冷驯化的进一步研究奠定理论基础。

植物；冷反应基因；信号转导；表达调节

据估计，每年世界主要农作物产量损失的一半以上是由非生物胁迫造成，低温冷害是其中一个主要的胁迫类型。因为地球陆地面积中，大约有42%的区域要经历阶段性或长期的-20℃以下的低温。所以，研究植物对低温的反应机制有重要的理论意义和应用价值。经过多年的探索，人们对植物的低温反应机理已有了一些认识，本文是对植物冷反应基因（cold-responsive genes，CORs）的激活与调节等方面的研究进展作一综述，旨在为植物冷驯化的进一步研究奠定理论基础。

1 植物的冷驯化与冷反应基因

低温寒冻是从亚热带到寒带等广大地区植物生长和发育的重要限制因素，是影响农林业生产的严重自然灾害。但这些地区的多种植物经过长期的进化，已对低温环境产生了一定的适应能力，进化出一套适应低温的冷驯化机制，即它们在经受一段时间的非伤害低温作用后，可使其耐低温能力大大提升［1，2］。如黑麦在未经低温驯化处理时，-5℃条件下就会被冻死，而经过一段时间的低温驯化后，植株体可在-30℃条件下生存；北美杜鹃在冷驯化前后的耐冻能力分别为-7℃和-53℃［3］。

植物冷驯化的关键在于激活了大量的CORs，合成了多种冷诱导蛋白，从而启动了多重增强植物抗冻性的生理机制［1，3］。Lee等［4］用微阵列分析揭示，拟南芥的24 000个基因中可被低温诱导表达的基因有655个，下调表达的有284个，CORs在其基因组中约占20%；对茶树低温诱导转录组的分析也发现，有1 770个CORs（其中1 162个表达上调，602个被下调）［5］。至于CORs编码产物的功能，目前的研究已表明，它们参与细胞的结构和代谢的多个环节，有信号转导相关蛋白［如磷脂酶C（PLC）和钙调素（CaM）等］、转录因子［如CBF（C-repeat binding factor）和ICE（inducer of CBF expression）等］以及多种与初级和次级代谢有关的酶（如甘油二酯激酶、过氧化物酶和脱水素等）。

2 植物冷反应基因的激活

植物CORs的激活涉及其冷驯化期间一系列复杂的信号感受、信息传递、基因表达和代谢模式改变等生理生化及分子生物学水平的复杂变化过程。对植物细胞低温感受器的大量研究显示，其低温感知可能源自原生质膜物理化学性质的改变，因低温可降低膜的流动性、增加其僵硬程度。如实验证明，一种膜硬化剂——二甲基亚砜（DMSO）在25℃下也能诱导CORs基因，而增加膜流动性的苯甲醇甚至可在0℃下阻止CORs基因的表达；对拟南芥中油酸脱氢酶基因受损的fad2突变体的研究表明，野生型拟南芥植株的甘油二酯（DAG）激酶被诱导表达的温度是14℃，而fad2突变体（其膜脂的饱和度变高）和亚油酸去饱和酶基因高表达的转基因拟南芥植株的甘油二酯激酶分别在18℃和12℃时表达［6］。

低温信号被植物细胞感受后，其信号传递的第二信使很可能是胞质Ca2+水平的变化。冷诱导的胞质Ca2+浓度增加可能是通过膜上机械张力敏感的或配体激活的Ca2+通道来实现的。例如，用一种机械张力敏感的钙离子通道阻滞剂——钼酸钆处理膜硬化的细胞，可阻断或减弱胞质Ca2+信号和CORs基因的表达。利用膜片钳技术对拟南芥叶肉细胞原生质体质膜冷诱导的膜电位变化的研究也显示，冷活化的Ca2+通道才是胞质Ca2+信号的发源地［7，8］。而在紫花苜蓿（Alfalfa）和油菜（Brassica napus）研究中还发现，Ca2+通道开启和细胞内Ca2+浓度增加还与冷诱导的质膜僵硬引起的细胞微丝骨架重排有关［8］。总之，植物抗冻性对胞质Ca2+浓度变化存在着依赖性。

Ca2+涌入细胞即激活了磷脂酶C和磷脂酶D（PLD），催化产生的肌醇-1，4，5-三磷酸（IP3）等可进一步活化存在于胞内钙库膜上的IP3门控Ca2+通道而放大Ca2+信号。细胞内Ca2+信号的接受者（或称Ca2+感受器）有多个成员，如钙依赖型蛋白激酶（CDPK）、CaM、钙调磷酸酶B类蛋白（CBL）或类盐高敏感蛋白-3（类SOS3）、蛋白磷酸酶2C（PP2C）等。冷胁迫产生的Ca2+信号就是通过它们而向下传递，从而引起COR基因的表达变化和植物耐冷性的增强［9，10］。CDPK（Ca2+dependent protein kinase）是一类丝/苏氨酸蛋白激酶，依赖Ca2+但不依赖CaM，因为在这类蛋白激酶的C端有一段类似于CaM的结构域。在细胞内，CDPK几乎遍布于所有细胞器中，并在非生物胁迫时被诱导或激活［11］。

3 植物冷反应基因表达的调节

现已基本查明拟南芥等植物的冷信号的进一步转导至少可通过依赖CBF和不依赖CBF两条途径来完成。依赖CBF的冷信号转导通路（又称ABA非依赖信号转导途径）已被证实是赋予植物低温抗性的主效途径，因而使其成为低温抗性领域研究的热点之一。该信号途径可较好的解释草本植物的冷驯化过程。即植物在感知低温后，启动CBF基因表达，其编码蛋白再激活下游启动子中包含有C-重复（C-repeat，CRT）/DRE元件（dehydration responsive element）的冷反应基因（CORs）表达。CBF属于乙烯反应元件结合因子/APETALA2（ERF/AP2）型转录因子家族。受CBF调控的CORs已发现至少有几十种（如rd29、corl5A和cor47等），它们的编码蛋白在低温下合成后，引起组织细胞一系列生理生化变化，稳定细胞或蛋白的结构，恢复植物体内物质和能量代谢平衡，增强植物对低温环境的适应性。因此，人们把CBF转录因子看作冷驯化的开关。而冷驯化时被激活的许多基因都属于CBF调节的下游基因［1，4］。

拟南芥的CBF基因家族包括CBF1、CBF2和CBF3三个基因，聚集在拟南芥第4染色体短臂上［1，12］。实验表明，拟南芥的3种CBF转录因子虽然都能启动下游CORs的表达，但功能有一定差别，CBF1和CBF3的表达要先于CBF2基因，并对CBF2的表达起促进作用；而CBF2蛋白是CBFI和CBF3表达的负调节子。这样也许可以保证几个CBF基因表达是瞬时的、可控的，同时能确保其表达水平适合于诱导下游基因的表达，使拟南芥获得抵抗寒冷和相关胁迫的能力。通常，当低温诱导时，CBF1和CBF3基因优先表达，当积累到一定水平时，CBF2基因开始表达，产生的CBF2蛋白抑制CBF1和CBF3基因的表达，使CBF蛋白保持在适合需要的水平［1，12］。

CBF基因也受低温诱导，在植物遭受低温时，CBF转录本在15 min内即开始积累，2 h后含有CRT/DRE元件的一组CORs基因开始表达。但是，CBF基因的启动子中不含CRT/DRE元件，且表达先于带有DRE/CRT顺式元件的CORs基因，因此，Gilmour等［13］提出，在正常生长温度下，细胞内已存在有识别CBF启动子的转录激活因子，并将这种未知的激活因子命名为“ICE”（inducer of CBF expression）蛋白。Chinnusamy于2003年分离得到了一个ICE1转录因子，它能识别CBF3启动子区域的ICE盒子［14］。同年Daniel等［15］通过CBF2启动子突变分析，鉴定出了两个ICE盒：ICEr1（CACATG）和ICEr2（ACTCCG），而且，在ICEr1中存在一个保守的bHLH碱性螺旋-环-螺旋（basic helixloop-helix）转录因子结合位点（CANNTG）。ICEr1或ICEr2单独存在时，对低温的响应很弱，但当它们同时存在时对低温的响应能力大大增强。现已查明，ICE1属于组成型表达基因，编码含bHLH的MYC类（MYC-like transcription factors）转录激活因子。在正常环境温度时ICE1蛋白处于无活性状态，低温下被活化，特异性结合到CBF启动子的顺式作用元件（CANNTG）上，以主效开关的作用控制着CBF信号转导途径各组分的表达水平。大约40%的CORs和46%的冷调节转录因子基因被ICE1调节，说明尽管植物的冷驯化机制相当复杂，ICE1是CORs表达的主要调节者［12，16］。对ICE1和CBF转基因植物抗寒性的研究，人们发现将CamV35S控制下的ICE1基因转入拟南芥中，所得到的转基因植株抗冻性与野生型植株相比有很大的提高；超表达LeCBF1和AtCBF3的转基因番茄和拟南芥植株抗寒性也都明显增强，但组成型表达CBF的转基因植株（包括拟南芥、油菜、番茄、土豆和水稻等不同物种）都导致在正常条件下严重生长迟滞和开花延迟［1，7］。这些研究结果改变了过去人们将植物耐寒性当作数量性状，认为由微效多基因共同控制，单独改变其中几个基因对植株的耐寒性影响不大的观点。

CBF基因启动子内除有MYC（如ICE）转录因子的识别区域外，还存在MYB类转录因子的识别区域［13］，研究表明MYB和MYC两类转录因子协同调控CBF的表达，MYC主要表现为激活作用，而MYB主要表现为抑制作用。MYB15结合到CBF启动子上抑制CBF及其调节元基因的表达。而ICE1负调节MYB15表达。Su等［17］在水稻发现了一条新的冷适应信号转导途径，他们通过功能缺失和获得实验分析发现，一个结合DNA单一重复的、介导水稻糖信号转导的MYB转录因子——MYBS3，在水稻耐冷适应也起着关键作用，它对于提高水稻耐冷性是充分和必要的。组成型表达MYBS3的转基因水稻至少可耐受一周的4℃低温，与正常条件下的植株相比不产生明显的差异。并通过过表达或抑制MYBS3表达的转基因水稻的转录分析，鉴定出了多个MYBS3介导的冷信号途径的基因，其中包括一些以前已被证明的可被MYBS3和冷所诱导激活的基因。而且发现，在水稻中MYBS3在转录水平上抑制著名的CBF依赖的冷信号转导途径。CBF反应迅速而短暂，但MYBS3对冷胁迫反应慢，由此暗示水稻为适应短期和长期的冷胁迫可采用不同的补偿途径。

另外，调节CBF表达的蛋白还有HOS1（High expression of osmotically responsive gene）、LOS4（Low expression of osmotically responsive genes 4）和MYB15等。HOS1是一种环指型泛素E3连接酶（RING E3 ligase）。适宜温度下，HOS1进入细胞核，使ICE1和CBF多聚泛素化而被蛋白酶体降解。在HOS1组成型表达的转基因植物中ICE1含量低，CBF及下游基因的表达受到抑制，植物的抗寒性大大降低［18］，所以HOS1是ICE和CBF的负调节子。SUMO（一种分子量约为11 kD的泛素类似蛋白）化翻译后修饰也控制着ICE1依赖的冷信号转导，ICE1和CBF的SUMO化阻断了它们的多聚泛素化，表明泛素化和SUMO化修饰在功能上是竞争的。LOS4编码一个DEAD-box RNA解旋酶（dead-box RNA heliease），可调节CBF基因的表达。FIERY2（FRY2）编码一个转录抑制因子，此蛋白包含有两个双链RNA的结合域和1个与RNA酶ⅡC 末端起催化作用的结构同源的区域，RNA酶Ⅱ的这个区域在酵母和动物中可以调节基因的表达，说明FRY2可能调节抗逆基因的转录；CAX1（calcium exchanger 1）编码液泡中的一个Ca2+/H+反转运子，而此转运子可以调节细胞内部的Ca2+水平。正常条件下，CAX1突变体植株的抗旱、耐盐和抗寒能力与对照植株无明显区别，但在冷驯化的条件下，CBF及其下游靶基因的表达都有所提高，说明CAX1通过控制CBF及其下游基因的表达，来保证拟南芥冷驯化的精确性［12，18，19］。最近，Shan等［20］在研究丙烯诱导香蕉果实的耐冷性与MaNAC1（香蕉的一种NAC类转录因子）基因的关系时发现，可被冷胁迫显著诱导、在冷藏期间也被丙烯处理而显著诱导的MaNAC1基因是MaICE1的一个新的直接靶点，MaNAC1是ICE1冷信号通路的一个下游组件。而MaICE1 与MaNAC1启动子的结合能力可被MaICE1磷酸化和冷胁迫增强。这一研究结果丰富了人们对ICE1冷信号传导在CBF之外的一个新的直接靶点、新的反应支路的认识。

植物对低温等非生物逆境胁迫反应的调控还涉及脱落酸（abscisic acid，ABA）介导的信号途径。该途径是通过上游转录因子与ABA合成基因启动子中的DRE（dehydration-responsive element）顺式元件结合，激活ABA合成相关基因的表达，引起植株体内ABA含量上升，从而增强对低温等逆境胁迫的耐受能力。但有时候这两条途径也存在交叉与互作［19］。

冷诱导基因的转录后调节还涉及前体mRNA加工和从细胞核输出的转录后调控环节，最近在拟南芥和水稻的研究中已证明，小分子非编码RNA（miRNA和siRNA）是造成转录后基因沉默的关键因子，在其冷响应基因表达的转录后调节中发挥着重要作用［19，21-23］。

Lee等［23］的研究还表明，在冷处理6 h以内，被上调的早期冷反应基因主要与转录和细胞信号转导相关。在冷胁迫早期有多个转录因子被诱导，而表达被抑制的转录因子基因很少，说明植物对冷的反应最初主要是通过基因的转录激活，而不是转录抑制。而晚期（24 h冷处理）冷反应基因多与基因转录及代谢活动相关，此时所诱导的一些冷调节的受体样蛋白激酶可能涉及到由早期冷反应所产生的次级信号的感受。另外，美国亚利桑拉大学的Lee等［24］在研究植物的低温信号转导时发现，线粒体复合物I的缺损降低了核基因在低温条件下的表达，由此提出了“核基因的冷诱导表达还受线粒体功能的调节”的观点。

尽管拟南芥等草本植物冷驯化的分子机理已得到较深入地研究，但木本植物的冷驯化与草本植物有所不同，其冷驯化能力更大，冷驯化机制也更复杂。Wisniewskia等［25］发现，筛选到的苹果的冷反应基因中，尽管有70%左右与数据库中的CORs高度相似，但还有超过20%的基因是全新的。目前，已有多种木本植物（如茶树、蓝莓、北美杜鹃、苹果、杨树和海滨松等）的低温反应表达序列标签（EST）被通过不同途径筛选了出来，其中也有不少基因已得到了进一步研究［25-27］，可以预期在不久的将来，该领域必定会出现一些振奋人心的研究成果。

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（责任编辑 马鑫）

Activation and Regulation on the Cold Response Pathway of ICE1-CBF in Plants

Wei Junyan1Zhao Jia2Zhao Shiqi1Zhou Qiying1Yuan Zhengfang1Li Xianwen1
（1. College of Life Sciences，Xinyang Normal University，Xinyang 464000；2. Hua-Rui College，Xinyang Normal University，Xinyang 464000）

Cold stress signal is sensed while changes of cell membrane fluidity in plant cells cause the changes of Ca2+influx. The rising of Ca2+in cytoplasm leads to the changes of activities of various calcium-regulating proteins in plant cells， then cold-responsive genes are activated by cascade reactions， and thus plant resistance to low temperature is enhanced. At present， it is almost certain that the main path of activating cold-responsive genes is ICE1-CBF regulatory pathway. In this paper. We review the recent studies of the cold signal sensing and transduction，expression activation and regulation of cold-responsive genes in plant cells， which lays the theoretical foundation for the further study of cold acclimation of plants.

plants；cold-responsive genes；signal transduction；regulation of gene expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.016

2014-10-20

国家自然科学基金项目（31270727，U1404319），河南省重点科技攻关项目（082102150009）

魏俊燕，女，硕士研究生，研究方向：植物分子生物学；E-mail：1039752416@qq.com

李先文，男，博士，教授，研究方向：植物胁迫生理学与分子生物学；E-mail：xianwenli01@sina.com