GRB7家族蛋白的功能及研究进展

巩 斌, 熊燊源, 李良远, 代 蓉, 杨菊凤, 万鹏程, 石国庆

(1. 石河子大学 动物科技学院， 石河子 832000； 2.新疆农垦科学院畜牧兽医研究所，石河子 832000； 3. 山东畜牧兽医职业学院， 潍坊 261061)

GRB7家族蛋白的功能及研究进展

巩 斌1， 2, 熊燊源1， 2, 李良远1, 代 蓉2, 杨菊凤3, 万鹏程2, 石国庆2

(1. 石河子大学 动物科技学院， 石河子 832000； 2.新疆农垦科学院畜牧兽医研究所，石河子 832000； 3. 山东畜牧兽医职业学院， 潍坊 261061)

GRB7及其家族成员GRB10和GRB14都是重要的衔接蛋白，含有3种结构区域：N端的富含脯氨酸区、中间的GM区和C端的SH2结构域。GRB7家族蛋白通过与不同酪氨酸激酶受体及其他含磷氨基酸蛋白相互作用调控许多细胞的功能，如细胞迁移、肿瘤发生、基因表达、血管形成、胚胎发育和代谢调控等。描述了grb7、grb10和grb14的生物学功能和涉及的表达调控机制。

衔接蛋白; GRB7; GRB10; GRB14

生长因子受体结合蛋白7(GRB7)家族是由GRB7、GRB10和GRB14 3个成员组成，它们每一个成员都存在许多个剪接变体。这些衔接蛋白发现于哺乳动物细胞，能识别结合多个细胞表面受体及下游信号，从而与其他蛋白产生相互作用。GRB7家族蛋白在不同组织中差异表达，它们的激酶反应尚未被完全证实，但它们的磷酸化位点在丝氨酸、苏氨酸和络氨酸。GRB7家族蛋白主要定位于胞浆，在质膜、灶性接触和部分线粒体中也有发现，主要通过SH2结构域与许多受体酪氨酸激酶和其他信号分子连接。GRB7主要调节肿瘤的侵袭与转移和哺乳动物胚胎迁移[1-2]，GRB10主要调控哺乳动物生长发育、原肠运动和血糖调节等，GRB14主要在胰岛素信号和成纤维细胞生长因子(FGF)信号调节上有重要作用[3]。

1 GRB7家族蛋白概况

GRB7家族蛋白由GRB7、GRB10和GRB14 3个成员构成。该家族成员包含了保守的RA(Ras Associating)、PH(Pleckstrin Homology)、BPS(Between Pleckstrin and Src)和SH2(Src Homology 2)结构域，其中RA、PH、BPS结构域与MIG-10(mitogen inducible gene-10)具有同源性也称为GM结构域[4]，故结构上具有3个保守区域[5]：氨基端的富含脯氨酸区、中间的GM区和羧基端的SH2结构域。该蛋白家族的成员与许多信号通路有关[6]，包括：胰岛素、成纤维细胞生长因子受体(Fibroblast growth factor receptor, FGFR)、局部黏着斑激酶(Focal adhesion kinase, FAK)、血小板衍生生长因子受体(Platelet-derived growth factor receptor, PDGFR)和表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor, EGFR)等。作用机制是被称为衔接(adaptor)蛋白的GRB7/10/14通过SH2结构域直接结合磷酸化的受体酪氨酸激酶位点。

2 GRB7家族蛋白的功能与机理

2.1 GRB7蛋白

GRB7蛋白是一个含535个氨基酸残基的蛋白,结构中SH2结构域是识别胞膜酪氨酸激酶受体参与级联酶促反应的位点。GRB7的分布具有明显的组织特异性，人体内在胰腺表达较高，肾、胎盘、前列腺及小肠表达适中，结肠、肝脏、肺及睾丸表达较低。GRB7是重要的衔接蛋白，主要调节肿瘤的侵袭与转移和哺乳动物胚胎迁移[2-3]。

2.1.1 肿瘤的侵袭与转移 人体上GRB7定位17号染色体17q12～21区，研究表明在许多乳腺癌细胞grb7与her2表现共同高表达[7]。关于GRB7肿瘤侵袭转移方面的研究，证实GRB7高表达病例的侵袭转移能力显著强于低表达病例。有研究表明，GRB7、ERK和FOXM1的异常上调和激活与人类肿瘤细胞的攻击性有密切联系[8]，主要依靠羧基端的SH2结构域,GRB7参与介导FAK受体和EPHB1受体的信号通路,调控肿瘤的发生与转移。在人胃癌和食管癌细胞系，包括原发性胃癌和食道癌，尤其在食道下段，grb7和erbb2共同扩增或过表达。部分食道癌患者中，检测不到grb7扩增，但其mRNA同erbb2或egfr一起过表达或共表达[9]。已知ERBB2阳性的肿瘤细胞，细胞增殖能力强，恶性程度高，GRB7和ERBB2共高表达的乳腺癌患者易发生肿瘤细胞转移[10-11]。有研究发现，外周淋巴结转移的N1期胰腺癌细胞在非磷酸化肽段作用下可以抑制GRB7与FAK结合，癌细胞在纤黏蛋白中的转移能力明显下降，体外实验证实了GRB7可以抑制癌细胞的迁移和转移，但不影响癌细胞的增殖。肿瘤领域研究证实，GRB7高表达会引起其侵袭与转移的活性改善。

2.1.2 哺乳动物胚胎迁移 GRB7通过其PH结构域与磷脂如磷酸肌醇相互作用，可能涉及哺乳动物早期胚胎的运动。GRB7还可以通过其RA结构域与RAS蛋白产生相互作用，影响细胞的生长、分化和蛋白的分泌、运输。体外实验发现GRB7通过与FAK或EPHB1受体的直接相互作用，参与整联蛋白介导的细胞迁移[12]。研究发现，GRB7的GM区跟胚胎发育中参与神经细胞迁移的MIG-10蛋白具有高度同源性[4]，推测GRB7可能涉及动物胚胎发育迁移。GRB7对细胞迁移和肿瘤转移具有调控作用[13]，早期胚胎附植与肿瘤侵袭过程具有极大的相似性。汤军等[2]在早孕小鼠的研究表明，经荧光定量PCR分别检测未孕(d0)和怀孕早期(d1-7)小鼠子宫内膜组织发现均有GRB7 mRNA表达，且怀孕第5天达到峰值，免疫组化和蛋白印迹显示GRB7蛋白表达规律与荧光定量PCR基本一致，提示它可能涉及子宫内膜细胞分化、蜕膜化和维持妊娠等相关内容。前期预实验，经组织表达谱检测绵羊胚胎附植期grb7表达具有组织特异性，GRB7的mRNA在脾脏、垂体、肾脏、输卵管、卵巢、膀胱及子宫体等组织出现表达，且子宫体、输卵管及肾脏呈现较高含量。利用荧光定量PCR检测GRB7的mRNA在绵羊胚胎附植期子宫内膜组织的表达情况，发现mRNA表达呈动态变化,推测GRB7可能在绵羊胚胎附植中发挥一定作用。

2.2 GRB10蛋白

GRB10含有600个氨基酸残基，广泛存在哺乳动物各组织中，但表达不均匀。GRB10在小鼠上是在11号染色体，人和黑猩猩上定位7号染色体。目前，GRB10蛋白主要与胰岛素/胰岛素样信号通路相关联，主要参与配体诱导的受体泛素化和内吞过程。grb10转基因小鼠表现生长障碍，而小鼠grb10的敲除实验发现胚胎和胎盘大量增生，表明GRB10可能参与胚胎细胞生长调控和胰岛素信号通路调节[14-15]。

GRB7、GRB10、GRB14家族蛋白与许多信号通路相关联，GRB10主要与胰岛素信号调控的细胞生长有关。研究发现，小鼠胚胎e14.5，GRB10在响应胰岛素的组织如肌肉和肝脏广泛表达。有报道称，GRB10在小鼠胚胎前期和中期表达量较高[14]。张凌波等[16]研究显示，晚神经胚和尾芽时期的爪蟾胚胎中，GRB10广泛表达于肌肉和肝脏，原肠胚时期表达于中胚层和内胚层。

2.2.1 哺乳动物生长发育调控 GRB10蛋白是一种强效的生长抑制剂，涉及配体诱导的受体泛素化和内吞过程。细胞中不能被NEDD4泛素化，而是以GRB10/ NEDD4复合物的形式在NEDD4与IGF-IR之间发挥桥梁作用，调控泛素化和IGF-IR。GRB10蛋白能够调节细胞增殖，与NEDD4结合后负调控IGF-IR依赖性细胞增殖，增强IGF-I内源化、泛素化和IGF-IR的降解以及信号长期衰减。反之，利用NEDD4促进泛素化和内源化的作用与GRB10共同负调控IGF-I型依赖性细胞增殖[17]。利用GRB10对IGF-I的特异抑制性可以调控细胞信号和DNA合成。GRB10是重要的衔接蛋白，体外实验证实MEG1/GRB10是IR和IGF1R信号通路的接头蛋白。有报道，体内MEG1/GRB10同胰岛素和IGF-IR共同作用负调控IGFs[18]。出生3～4周断奶的MEG1、GRB10转基因小鼠生长迟缓，表示MEG1、GRB10异位表达对产后IGF-I的抑制是通过IGF1R介导实现的[19]。grb10转基因小鼠表现生长障碍,而基因敲除处理后会引起过度生长和骨骼肌肥大等不良发育，说明GRBl0与生长发育异常有关。最新报道发现GRB10是一种促进有丝分裂的衔接蛋白[20]。

2.2.2 原肠运动的调控 张凌波等[16]通过过表达和敲减实验证实GRB10涉及调节原肠运动中细胞运动。目前，WNT/PCP信号通路主要调节原肠运动，主要靶点是细胞骨架[21]，利用Frizzled-Dishevelled复合物向下游呈递信号，激活JNK和小G蛋白RHO。细胞骨架重组能够构建细胞极性和调节细胞运动。作为中心分子的Dishevelled是激活JNK和小G蛋白RHO的必要条件。张凌波等[16]研究显示，GRB10的过表达能够激活JNK，而且GRB10还是WNT11、FZ7和DSH激活JNK的必要条件。以上结果说明GRB10通过影响DSH或DSH下游组分参与传导了WNT、PCP信号。

原肠运动时期的细胞迁移和细胞运动均涉及细胞骨架重排和伪足形成。有研究发现IGF信号通路通过抑制XBRA的表达，可以间接调节原肠运动。有文献报道GRB10没有直接参与原肠运动中细胞迁移，但GRB10与EPHB1可以产生相互作用[22]，通过EPHRIN/EPH受体调节细胞运动。此外，有报道称GRB10能够与许多受体酪氨酸激酶(RTKs)相互作用参与调节原肠运动，比如ERB和ROR激酶[23-24]。综上所述，GRB10通过其包含的不同结构域与多种蛋白相互作用可能作为一种由受体向下游组分呈递信号的衔接蛋白。

2.2.3 血糖调控 GRB10与GRB14是联系密切的效应蛋白，能直接与胰岛素受体结合，调控胰岛素受体磷酸化，并向下游转导信号，最终引起血糖调控。grb10或grb14单一基因缺陷的小鼠均可随胰岛素信号上调呈现改善的血糖平衡，引起对应身体组成变化。小鼠基因敲除试验证实，敲除两个基因的复合体与缺失grb10相比呈现瘦肉量增加；其中某个基因缺失仍可使IRS-1的磷酸化水平和AKT活性水平上调，但两个基因同时缺失时胰岛素信号停止增强[18]，grb10的敲除提高了胰岛素信号和敏感性，GRB10过表达则涉及与胰岛素调控有关联的血糖运输[25]，以上说明GRB10和GRB14通过参与胰岛素信号调控共同调节糖代谢的同时还存在相对独立性调控。糖耐量的受损可能是II型糖尿病患者的病因。抗胰岛素的转基因小鼠表现高胰岛素水平，说明MEG1、GRB10与胰岛素存在级联负调节[19]，胰腺腺泡细胞表现严重萎缩可能与胰腺中MEG1/GRB10信号高表达有关。这种结果同样出现在if和igflr双敲除的小鼠，表示MEG1/GRB10对胰岛素和IGF-I受体的活性具有抑制作用。体内MEG1、GRB10信号与胰岛素和IGF-IR相互作用对IGFs增长途径负调控[18]。此外，GRB10构筑了自胚胎期至成体阶段葡萄糖代谢调控系统。

2.3 GRB14蛋白

人体上GRB14定位2号染色体2q22-24区[26]，含540个氨基酸残基，其mRNA表达具有组织特异性，心脏、肝脏、肾脏、胰脏、骨骼肌、卵巢和睾丸高表达，肾胚胎细胞、前列腺癌细胞系以及乳癌细胞中也大量存在。研究发现，GRB14主要在胰岛素信号和FGF信号调节上发挥重要功能[3]。

2.3.1 胰岛素信号调节 GRB10和GRB14是功能密切相关的效应蛋白，可以直接跟胰岛素受体作用，调控胰岛素受体磷酸化，grb10或grb14单一基因缺陷的小鼠均可随胰岛素信号上调呈现改善的血糖平衡，引起对应身体组成的改变。GRB14蛋白对胰岛素受体的功能活性具有抑制作用，在小鼠肝脏与胰岛素受体作用引起胰岛素受体催化活性改变和胰岛素强烈兴奋[27]。关于酪氨酸激酶的体外分析实验证实，GRB14通过影响受体的自磷酸化直接抑制胰岛素受体对底物的催化活性。有研究发现GRB14中PIR结构域涉及抑制胰岛素受体的催化活性。GRB14蛋白能调控胞内胰岛素活性，胰岛素与受体完成结合，胞内胰岛素活性首先呈现诱导其受体酪氨酸残基自磷酸化。这些残基位于胰岛素受体家族或含SH2结构域的蛋白，可以传递胰岛素信号，是细胞内特异性效应器的结合位点。

2.3.2 FGF信号调节 成纤维细胞生长因子家族(FGFs)总共由20多个生长因子组成, 是哺乳动物生长发育的决定性调节器。Grose等[28]认为FGFs的突变、表达和活性的失调都可能引起发育异常和肿瘤发生。赵志超等[29]利用组织表达谱对grb14进行检测发现，mRNA在肝脏、肾脏、输卵管、卵巢、黄体、垂体等组织高表达，经荧光定量PCR检测分析发现grb14在各级卵泡杜洛克猪和梅山猪表达量差异显著，由此推测GRB14可能与哺乳动物产仔数和胚胎生长发育有关。Cariou等[3]指出, FGFR是一种受体酪氨酸激酶，同胰岛素受体一样可以跟GRB14产生相互作用。有研究发现GRB14的mRNA在许多人乳腺和前列腺癌患者中高表达，表明GRB14可能正向调控细胞增生。有研究表明GRB14能够与活化的FGF受体结合，而在小鼠胚胎的成纤维细胞中发现，敲除grb14处理使FGF诱导的AKT磷酸化水平增强[30]。

3 展望

目前对人、猪、小鼠、爪蟾、绵羊等研究发现，GRB7主要调节肿瘤的侵袭与转移和哺乳动物胚胎迁移[1-2]，GRB10主要调控哺乳动物生长发育、原肠运动和血糖调节等，GRB14主要在胰岛素信号和FGF信号调节上有重要作用[3]。故认为GRB7家族蛋白成员可能在哺乳动物胚胎期和个体生长发育过程中发挥一定作用，也可能在反刍动物生长发育发挥重要影响，经前期预实验发现GRB7家族基因对绵羊胚胎附植可能产生一定影响，但未见此类报道，后期计划开展GRB7家族基因对反刍动物生长发育的基础研究。

反刍动物养殖是新疆畜牧业的支柱，对人民生活水平提高和社会经济发展意义重大。随着人口持续增长，当今社会的人地矛盾和粮食危机越来越严峻，大举发展反刍动物养殖成为养殖新方向，具有广阔的前景。因此，我们可以把grb7、grb10、grb14作为候选基因，对反刍动物生长发育调控机制进行研究，通过实时荧光定量RT-PCR、免疫组化和Western blot等方法研究基因在胚胎生长发育过程的时空表达调控机制，利用相应分子遗传标记研究基因的突变性对家畜经济性状的影响和在动物繁育的作用，以便为反刍动物后续品种改良和选育工作提供理论基础。

[1]Nencioni A, Cea M, Garuti A, et al. Grb7 upregulation is a molecular adaptation to HER2 signaling inhibition due to removal of Akt-mediated gene repression [J]. PLoS One, 2010, 5(2):1-10.

[2]汤 军,李 荣,耿艳清,等.GRB7基因在早孕小鼠子宫内膜中的表达[J]. 重庆医科大学学报, 2013,38(10)：1149-1153.

[3]Cariou B, Bereziat V, Moncoq K, et al. Regulation and functional roles of GRB14[J]. Front Biosci, 2004, 9: 1626-1636.

[4]Sharareh S R, Tabitha A P, Andrew M B, et al. Grb7 binds to Hax-1 and undergoes an intramolecular domain association that offers a model for Grb7 regulation[J]. J Mol Recognit, 2011, 24(2): 314-321.

[5]张 丹,高友鹤.生长因子受体结合蛋白7(Grb7)研究进展[J]. 基础医学与临床, 2011,31(4):467-470.

[6]Zhang D, Shao C, Hu S, et al. Novel nonphosphorylated peptides with conserved sequences selectively bind to Grb7 SH2 domain with affinity comparable to its phosphorylated ligand[J]. PLoS One, 2012, 7(11):1-8.

[7]Glynn R W, Miller N, Kerin M J.17q12-21-the pursuit of targeted therapy in breast cancer[J].Cancer Treat Rev, 2010, 36(3): 224-229.

[8]David W C, Winnie W Y, Patty C H, et al. Targeting GRB7/ERK/FOXM1 signaling pathway impairs aggressiveness of ovarian cancer cells[J]. PLoS One, 2012, 7(12): 1-10.

[9]Dahlberg P S, Jacobson B A, Dahal G, et al. ERBB2 amplifications in esophageal adenocarcinoma[J]. Ann Thoracic Surg. 2004, 78(5):1790-1800.

[10]Staaf J, Jensson G, Ringner M, et al. High-resolution genomic and expression analyses of copy number alterations in HER2-amplified breast cancer[J].Breast Cancer Res, 2010, 12(3): R25.doi: 10.1186/bcr2568.

[11]Bai T, Luoh S W. GRB-7 facilitates HER-2/Neu-mediated signal transduction and tumor formation[J]. Carcinogenesis, 2008, 29(3):473-479.

[12]Shen T L. Guan J L. Grb7 in intracellular signaling and its role in cell regulation[J]. Front Biosci, 2004, 9: 192-200.

[13]Sally C P, Tabitha A P, Dennis L J, et al. The intertwining of structure and function: proposed helix swapping of the SH2 domain of Grb7, A regulatory protein implicated in cancer progression and inflammation[J]. Crit Rev Immunol, 2010, 30(3):299-304.

[14]Charalambous M, Smith F M, Bennett W R, et al. Disruption of the imprinted Grb10 gene leads to disproportionate overgrowth by an Igf2-independent mechanism[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100: 8292-8297.

[15]Wang L, Balas B, Christ-Roberts C Y, et al. Peripheral disruption of the Grb10 gene enhances insulin signaling and sensitivity in vivo[J].Mol Cell Biol, 2007, 27: 6497-6505.

[16]张凌波.GRB10在爪蟾早期胚胎发育中的功能研究[D]. 北京:清华大学, 2008.

[17]Monami G, Emiliozzi V, Morrione A, et al. Grb10/Nedd4-mediated multiubiquitination of the insulin-like growth factor receptor regulates receptor internalization[J]. J Cell Physiol, 2008, 216: 426-437.

[18]刘 齐. Grb10基因在小鼠胚胎及胎盘的表达谱分析[D]. 哈尔滨:哈尔滨工业大学, 2010.

[19]Shiura H, Miyoshi N, Konishi A, et al. Meg1/Grb10 overexpression causes postnatal growth retardation and insulin resistance via negative modulation of the IGF1R and IR cascades[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2005, 329: 909-916.

[20]Deng Y, Zhang M, Riedel H. Mitogenic roles of Gab1 and Grb10 as direct cellular partners in the regulation of MAP kinase signaling[J]. J Cell Biochem, 2008, 105: 1172-1182.

[21]曾照辉. WNT6在骨肉瘤组织中的表达及临床意义及其对骨肉瘤细胞增殖侵袭的影响[D]. 西安:第四军医大学, 2013.

[22]Stein E, Cerretti D P, Daniel T O. Ligand activation of ELK receptor tyrosine kinase promotes its association with Grb10 and Grb2 in vascular endothelial cells[J]. J Biol Chem, 1996, 271: 23588-23593.

[23]Nie S, Chang C. Regulation ofXenopusgastrulation by ErbB signaling[J]. Dev Biol, 2007, 303: 93-107.

[24]Schambony A, Wedlich D. Wnt-5A/Ror2 regulate expression of XPAPC through an alternative noncanonical signaling pathway[J]. Dev Cell, 2007, 12:779-792.

[25]Ishizaki Y Y, Kayashima T, Mapendano C K, et al. Role of DNA methylation and histone H3 lysine 27 methylation in tissue-specific imprinting of mouseGrb10[J]. Mol Cell Biol, 2007(1): 732-742.

[26]Fernandez E L, Palmero I G, Villalobo A. Genomic, organization and control of the Grb7 gene family[J]. Current Genomics, 2008(9):60-68.

[27]高晓猛,张春雷,房兴堂,等.grbl4基因的功能及其研究进展[J].中国牛业科学,2012, 38(2):36-39.

[28]Grose R, Dickson C. Fibroblast growth factor signaling in tumorigenesis[J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2005, 16:179-186.

[29]赵志超,孙敬礼,黄 涛，等.杜洛克与梅山猪卵泡中Grb14、eIF4E和SNRPE基因的差异表达研究[J]. 石河子大学学报，2012, 30(6):704-708.

[30]Browaeys-Poly E, Blanquart C, Perdereau D, et al. Grb14 inhibits FGF receptor signal through the regulation of PLCγ recruitment and activation[J]. FEBS Letters, 2010, 584:4383-4388.

Progress in research on GRB7 protein family gene

GONG Bin1， 2, XIONG Shen-yuan1， 2, LI Liang-yuan1, DAI Rong2,YANG Ju-feng3, WAN Peng-cheng2, SHI Guo-qing2

(1. College of Animal Science and Technology, Shihezi University，Shihezi 832000； 2. Animal Husbandry and Veterinary Institute, Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science, Shihezi 832000；3. Shandong Animal Husbandry and Veterinary College, Weifang 261061, China)

The growth factor receptor bound 7(GRB7), 10(GRB10) and 14(GRB14) are very important adaptors. They have three distinct functional regions such as a lot of proline in their N terminal, the GM domain in the mesial district and a SH2 domain in their C terminal. The GRB7 protein family regulates multiple cellular functions such as cell migration, tumorigenesis, gene expression, angiogenesis, embryonic development and metabolism regulation, etc, by interacting with different tyrosine kinase receptors and other phosphor-tyrosine proteins. This article summarized the biological functions and the genetic variation of the gene of the growth factor receptor bound 7(GRB7), the growth factor receptor bound 10(GRB10) and the growth factor receptor bound 14(GRB14).

adaptor; GRB7; GRB10; GRB14

2014-11-24；

2015-01-13

国家自然科学基金(31160460)；国家科技支撑计划(2011BAD28B05-1-1)；863计划(2011AA100307)；新疆兵团绵羊繁育生物技术重点实验室开放课题(2013KLS02)

巩斌，硕士研究生，研究方向为动物遗传育种与繁殖，E-mail：1156199957@qq.com；

万鹏程，副研究员，硕士生导师，研究方向为绵羊繁育与家畜胚胎生物技术研究，E-mail：pengcheng.wan@gmail.com；石国庆，研究员, 博士生导师，研究方向为绵羊繁育与家畜胚胎生物技术研究，E-mail：nkkxyxms@163.com。

Q75

A

2095-1736(2015)05-0080-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.05.080