KSHV编码vGPCR影响斑马鱼胚胎血管发育

肖俊 徐旸 郑洁莹 刘利群 冯浩

摘要卡波氏肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）编码的G蛋白偶联受体（vGPCR）是病毒致瘤蛋白，能够促使宿主血管增生以及肿瘤发生.本研究采用显微注射法将vGPCR基因导入单细胞期斑马鱼受精卵；利用形态学观察、RTPCR、血管生成定量分析和血管染色法分析vGPCR对斑马鱼胚胎早期发育的影响.实验结果表明：vGPCR对斑马鱼胚胎早期形态发育无明显影响，但能导致斑马鱼胚胎肠下静脉血管形态产生畸形.本研究首次表明斑马鱼能够成为vGPCR致病机理研究的模式生物.

关键词vGPCR；斑马鱼；血管生成

中图分类号R7322；R51291文献标识码A文章编号10002537（2015）01001706

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒（Kaposis sarcomaassociated herpesvirus， KSHV）又名人类第8型疱疹病毒（HHV8），是新近发现的一种肿瘤病毒，隶属于γ疱疹病毒.KHSV是卡波氏肉瘤（KS）、原发性渗出性淋巴瘤（PEL）和多中心性巨大淋巴结增生症（MCD）的直接病因[13]. KSHV为DNA病毒，其基因组全长约165～170 kb， 编码 80个以上的病毒多肽.KSHV编码的诸多病毒蛋白能调节宿主炎症反应、促进宿主血管增生或肿瘤发生， 其中G蛋白偶联受体（vGPCR或ORF74）就是典型代表之一[4].

vGPCR是持续活化的受体，即vGPCR不管是否同配体结合都能够激活下游信号通道；然而配体的结合也能够调节vGPCR介导的信号通道，诸如：GROα上调、IP10抑制其信号传导.vGPCR的表达能够激活多个信号通路和诸多转录因子，从而增强促炎症细胞因子和血管生成细胞因子的产生，诸如：GROα、人类白细胞介素8受体（IL8）和血管内皮生长因子（VEGF）等.vGPCR是KSHV中被确认的癌基因，其在裸鼠中的表达能够引起肿瘤发生，vGPCR转基因小鼠也能够形成类似人类KS的病变[57].

在人类疾病研究中较常采用的模型为小鼠，然而由于小鼠自身的生物学特性，其在疾病研究中存在操作较复杂、实验周期较长等局限性.斑马鱼较其他脊椎动物模型相比具有许多优势，诸如怀卵量大、胚胎透明和胚胎生长发育快等.随着对斑马鱼胚胎的遗传学修饰技术的不断进步与完善，利用斑马鱼建立人类疾病研究模型逐步成为新的研究热点[89].现已成功建立的斑马鱼肿瘤研究模型有黑色素瘤模型和白血病模型等[1011].除肿瘤研究外，斑马鱼已成功应用于造血系统疾病、心血管疾病、眼科疾病、骨骼相关疾病、神经系统疾病和药物成瘾等方面的研究[12]，然而，有关以斑马鱼为模型来探究人类病毒致病机理的报道却十分罕见.

卡波氏肉瘤（KS）是一种KSHV感染导致的血管增生肿瘤，研究KS中血管增生过程并在其基础上研制抑制新生血管生成的方法有可能是防治KS的有效手段之一.斑马鱼血管系统与高等脊椎动物血管系统具有一定相似性，斑马鱼肿瘤病变中也存在血管扭曲、形态不规则及管壁厚度改变等现象.虽然斑马鱼是一种理想的血管疾病研究模型，有关采用斑马鱼对KSHV致病机理进行研究尚无报道.

本研究首次以斑马鱼为模型，采用显微注射的方式将vGPCR基因导入斑马鱼单细胞期受精卵，探究vGPCR对斑马鱼早期胚胎发育尤其是胚胎血管发育的影响.研究结果表明vGPCR能在斑马鱼胚胎中表达，且对斑马鱼胚胎早期形态发育和胚胎血管生成总量无明显影响，但能导致注射后72 h幼鱼肠下静脉血管形态产生畸形.这也证明了斑马鱼可以成为KSHV致病机制研究的模式生物.

1 材料与方法

1.1实验材料与试剂

本研究所用AB系斑马鱼购自国家斑马鱼资源中心；pCDHCMVMCSEF1copGFP质粒由本实验室保存；抗HA单抗（HA3663），氮蓝四唑（Nitroblue tetrazolium chloride，NBT）， 5溴4氯3吲哚基磷酸盐（5bromo4chloro3indolylphosphate，BCIP） 和苯硫脲（Phenylthiourea，PTU）购自Sigma公司；PVDF膜购自BioRad公司；PNPP底物试剂盒购自Thermo Scientfic公司；牛血清白蛋白（BSA）购自上海生工生物工程有限公司；Total RNA提取及cDNA合成试剂盒购自Promega公司.

1.2显微注射载体的构建

以pcDNA5/FRT/TOHAvGPCR为模板，利用PCR方法扩增HAvGPCR的DNA片段[4]，回收后将其与空载体pCDHCMVMCSEF1copGFP同时进行XbaI和NotI双酶切，再用T4连接酶连接，筛选阳性克隆，提取质粒并进行酶切鉴定和测序鉴定，构建成pCDHCMVHAvGPCREF1copGFP载体.

1.3细胞转染及蛋白印迹

HEK293T细胞保存于本实验室，使用含10%胎牛血清、5 mmol/L L谷氨酰胺、100单位/mL青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM培养基培养.通过磷酸钙转染法将目的载体pCDHCMVHAvGPCREF1copGFP转染到HEK293T细胞中，同时设置转染空载体的对照组.转染48 h后收获细胞，提取总蛋白， 10%SDSPAGE凝胶电泳分离目的蛋白.以AntiHA为一抗（稀释比例1∶2 000）对目的蛋白进行Western Blot检测，使用ECL反应液对目的带显色.

1.4显微注射

实验用斑马鱼饲养于本实验室自动循环水装置中，水恒温28.5 ℃，14 h/10 h光暗周期，每日喂食3次.产卵前一日取野生型斑马鱼按照雌雄比1∶2的比例放于产卵器内，隔开并遮光过夜.第二日清晨给予光照并使雌雄鱼交配，每对鱼可产100～150颗卵.收集鱼卵，用曝气水清洗后平均分为两组用于显微注射.

将受精卵分为实验组与对照组，当受精卵发育至1细胞期时，在体视显微镜下采用显微注射仪将质粒注射至受精卵动物极.实验组注射pCDHCMVHAvGPCREF1copGFP质粒，对照组注射pCDHCMVMCSEF1copGFP空载体，每个受精卵注射约2 nL质粒（浓度为100 ng/μL）.经过注射的胚胎置于28.5 ℃培养，注射后22 h添加苯硫脲（PTU）至浓度为0.2 mmol/L，以防止胚胎黑色素形成.

1.5胚胎观察

显微注射后，在28.5℃环境下持续观察实验组与对照组受精卵形态发育及绿色荧光蛋白（GFP）表达情况，统计胚胎存活率、荧光表达率，拍照并筛选出表达荧光蛋白的斑马鱼胚胎作为后续实验材料.

1.6RTPCR

注射约72 h后，分别将实验组和对照组已出膜斑马鱼幼鱼用Trizol试剂提取总RNA后使用DNase I在37 ℃条件消化1 h，RTPCR检测vGPCR在斑马鱼胚胎中的转录水平.引物Pa（ATGGCGGCCGAGGATTTC）位于vGPCR基因编码区5′端，Pb （CTACGTGGTGGCGCCGG） 位于vGPCR基因编码区3′端.选取βactin作为内参基因，引物AF（CATGTTCGAGACCTT）和AR（AGGCAGCTCATAGCT）来扩增350 bp的βactin片段.

1.7血管生成检测

整胚内源性碱性磷酸酶（Endogenous alkaline phosphatase， EAP）定量分析：选取24 hpf和72 hpf的胚胎进行碱性磷酸酶定量分析，测定血管生成量[13].

血管染色：选取72 hpf的胚胎使用NBT与BCIP染液进行血管染色[14]并采集图像进行分析.

1.8数据处理

分别统计25次显微注射重复实验中实验组及对照组胚胎的存活数目、GFP表达数目及血管发育畸形的胚胎数目，并计算存活率、GFP表达率和血管发育畸形率.数据采用Excel软件处理，对各实验数据采用单因素方差分析（oneway ANOVA）进行比较.

2结果

2.1vGPCR表达载体的构建

设计引物扩增HAvGPCR并将其插入pCDHCMVMCSEF1copGFP的XbaⅠ和NotⅠ酶切位点之间，酶切、测序鉴定证明vGPCR序列已正确插入（图1A）.采用vGPCR表达载体pCDHCMVHAvGPCRcopGFP转染HEK293T细胞，转染48 h后收集细胞，提取全细胞蛋白并进行蛋白质印迹杂交.结果显示在37～47 kD附近出现特异性目的条带，表明CDHvGPCRcopGFP在细胞内成功表达vGPCR蛋白（图1B）.

2.2vGPCR对斑马鱼胚胎形态发育无明显影响

显微注射后，将实验组与对照组斑马鱼胚胎置于28.5 ℃培养，在荧光倒置显微镜下观察胚胎各时期的发育情况 （图2，彩图见封三）.实验组与对照组胚胎均可最早在囊胚期（约受精后6 h）检测到绿色荧光蛋白copGFP的表达，并且GFP可持续强烈表达至胚胎出膜（72 hpf）.GFP几乎在整个胚胎中都有表达，包括头部、躯干和卵黄囊.从开始注射到72 hpf过程中，实验组胚胎与对照组胚胎发育进程基本同步且形态发育均正常.

分别收集实验组与对照组（72 hpf）中表达绿色荧光蛋白的胚胎，每30个胚胎为一组提取总RNA，逆转录后得到cDNA并采用Pa和Pb引物对vGPCR基因在斑马鱼胚胎中的转录情况进行检测.实验组RTPCR扩增出大小约为1 000 bp的目的条带，符合预计的vGPCR扩增结果；将该条带进行测序，结果表明实验组RTPCR扩增所得为vGPCR片段（图3）.

本研究共进行了25次显微注射实验，有效数据统计结果表明：显微注射后，实验组平均存活率为5080%，对照组平均存活率为55.02%（n=25，P>0.05）；实验组与对照组存活胚胎中平均GFP表达率分别为53.58%和48.16%（n=25，P>0.05）（表1）；实验组与对照组在存活率及荧光表达程度上均不存在显著性差异.显微注射实验结果表明vGPCR对斑马鱼早期胚胎形态发育无明显影响.

2.3vGPCR影响斑马鱼胚胎血管发育

斑马鱼胚胎早期发育时期（0～72 hpf）血管的生成量可以通过测量胚胎内源性碱性磷酸酶的含量来进行检测.斑马鱼胚胎在24 hpf时背主动脉、腹主静脉等主要血管已经形成，在72 hpf时肠下静脉等血管已经生成.在24 hpf和72 hpf两个时间点分别收集发绿色荧光的实验组与对照组胚胎，以20颗为一组进行EAP定量检测.反应产物在405 nm处的吸光值，可以反映胚胎内源性碱性磷酸酶的含量.24 hpf实验组与对照组的测量值分别为0.285与0.260， 72 hpf实验组与对照组的测量值分别为0.997与1.011，这两个时间点两组胚胎内源性碱性磷酸酶含量均相差不大.实验结果表明，注射vGPCR质粒的胚胎和注射对照空载体的胚胎在血管生成总量上并无太大区别（图4）.

在72 hpf时分别收集发绿色荧光的实验组与对照组胚胎，采用NBT和BCIP为染色剂对斑马鱼胚胎血管进行染色，可清楚直观地观察斑马鱼胚胎血管的生成情况.结果显示实验组约有28%的胚胎（图5）在注射vGPCR基因后，肠下静脉（Subintestinal Vein，SIV）出现了形状扭曲与血管排布紊乱，而对照组SIV则正常（图6）.实验组与对照组血管畸形率具有显著性差异，说明vGPCR的表达影响斑马鱼胚胎血管的形状和排布.

3讨论

卡波氏肉瘤（KS）是与艾滋病相关的恶性肿瘤，也是艾滋病致死的主要原因之一.KSHV是KS的直接病因，vGPCR是KSHV编码的病毒癌基因，其表达能够促进血管增生并导致肿瘤形成.斑马鱼具有早期胚胎体外发育、透明和几乎所有血管可视化等特点，使其成为研究血管发生理想的活体模型，但目前尚未见其用于KSHV及其病毒蛋白研究的相关报道.

为了探究斑马鱼能否成为研究KSHV及其病毒蛋白的新模型，本文以CDHCMVMCSEF1copGFP载体为基础构建了vGPCR的重组荧光表达载体CDHCMVvGPCREF1copGFP.采用显微注射技术将vGPCR重组质粒导入斑马鱼单细胞期受精卵后，能够用荧光显微镜观察到GFP在胚胎的表达； RTPCR结果证明了vGPCR在斑马鱼体内的mRNA转录，这些均说明vGPCR重组质粒在斑马鱼胚胎中得到成功表达.实验组RTPCR扩增vGPCR条带较微弱说明vGPCR在斑马鱼胚胎中的mRNA水平较低，本工作组曾尝试冰冻切片和原位杂交法检测vGPCR在斑马鱼胚胎中的蛋白表达，但由于vGPCR表达水平过低而无法鉴定，这些都符合之前的相关报道： vGPCR是KHSV中裂解表达基因，具有持续活化的特性，其持续表达对细胞具有毒性.因而，vGPCR在KS组织中表达水平较弱，且只有少数KS细胞表达vGPCR；表达vGPCR的KS细胞通过旁分泌的形式来诱导周围细胞增生和导致肿瘤发生.与此同时，KSHV也进化形成了诸多方式抑制vGPCR的表达来确保KSHV的潜伏感染和致病性，诸如KSHV编码的膜蛋白K7可以结合vGPCR并诱导其在内质网中的快速降解，从而削弱vGPCR介导的信号传导和致瘤性[4].

显微注射后实验组与对照组斑马鱼胚胎在存活率及荧光表达程度上无太大区别；实时跟踪观察结果表明vGPCR对斑马鱼早期胚胎形态发育无明显影响.vGPCR的表达能促进血管增生和肿瘤发生，本文采用碱性磷酸酶定量法检测斑马鱼胚胎血管生成情况，结果表明vGPCR的表达并未导致斑马鱼胚胎血管生成量增加.

碱性磷酸酶血管染色的结果表明，注射vGPCR基因（发绿色荧光）的实验组斑马鱼胚胎中，有28%的胚胎肠下静脉（SIV）出现了形状扭曲与血管排布紊乱，而注射空载体的对照组斑马鱼胚胎没有出现此现象.考虑到CDHCMVMCSEF1copGFP中目的基因vGPCR和copGFP是分别位于不同的启动子即CMV及EF1之后，28%的比例应该是比较高的.因此该实验结果清晰地表明vGPCR在斑马鱼胚胎中的表达对斑马鱼胚胎新生血管的形成具有致畸作用.

有研究表明将血管生成相关的因子FGF2（fibroblast growth factor）或VEGF（vascular endothelial growth factor）注射到斑马鱼受精卵中，实验组斑马鱼胚胎（48hpf）肠下静脉血管（SIV）有增生和畸形的现象[15].血管生成抑制性药物如SU5416和TNP470能够抑制肿瘤中血管的生成，使用SU5416或TNP470浸泡斑马鱼，发现斑马鱼胚胎SIV的生成得到了明显的抑制[14].与此同时，研究者发现采用注射morpholino至斑马鱼受精卵来敲降其内皮生长因子受体VGFR2/flk1时，斑马鱼胚胎（48 hpf）SIV出现畸形[16].这些研究结果均表明斑马鱼血管生成模型是研究肿瘤及血管系统的良好平台.KSHV是血管增生肿瘤KS的直接病因，本文将KSHV中致癌基因vGPCR导入斑马鱼受精卵，导致斑马鱼胚胎（72 hpf）肠下静脉血管（SIV）出现畸形，证明斑马鱼可以成为研究vGPCR甚至KSHV致病机理的有效模式生物.

肿瘤的生长和转移依赖血管的增生，肿瘤组织中血管生成过程受到一系列因子的调控.Notch信号通路中的Delta配体（Deltalike ligand 4/DLL4）在血管生成过程中具有有重要作用.研究者注射microRNA30靶向抑制斑马鱼胚胎中DLL4的表达，导致斑马鱼节间血管（intersegmental vessel， ISV）出芽、分枝等畸形现象[17].KSHV感染后的淋巴内皮细胞（lymphatic endothelial cells /LECs）中DLL4的表达明显增强，其原因主要在于vGPCR经由ERK信号通路刺激胞内DLL4的表达[18].这些暗示我们将来可通过分析vGPCRMAPKDLL4途径来阐明vGPCR导致斑马鱼胚胎SIV畸形的机理.

参考文献：

[1]CHANG Y， CESARMAN E， PESSIN M S， et al. Identification of herpesviruslike DNA sequences in AIDSassociated Kaposis sarcoma[J]. Science， 1994，266（5192）：18651869.

[2]CESARMAN E， CHANG Y， MOORE P S， et al. Kaposis sarcomaassociated herpesviruslike DNA sequences in AIDSrelated bodycavitybased lymphomas[J]. New Engl J Med， 1995，332（18）：11861191.

[3]NADOR R G， CESARMAN E， KNOWLES D M， et al. HerpesLike DNA Sequences in a BodyCavityBased Lymphoma in an HIVNegative Patient[J]. New Engl J Med， 1995，333（14）：943943.

[4]FENG H， DONG X， NEGAARD A， et al. Kaposis sarcomaassociated herpesvirus K7 induces viral G proteincoupled receptor degradation and reduces its tumorigenicity[J]. PLoS Pathogens， 2008，4（9）：e1000157.

[5]WANG Y， LU X， ZHU L， et al. IKK epsilon kinase is crucial for viral G proteincoupled receptor tumorigenesis[J]. Proc Nat Acad Sci USA， 2013，110（27）：1113911144.

[6]FENG H， SUN Z， FARZAN M R， et al. Sulfotyrosines of the Kaposis sarcomaassociated herpesvirus G proteincoupled receptor promote tumorigenesis through autocrine activation[J]. J Virol， 2010，84（7）：33513361.

[7]WU H， FU Y M， XIAO J， et al. The unsulfated extracellular Nterminus of vGPCR reduces the tumorigenicity of hGROα in nude mice[J]. Sci China Life Sci， 2013，56（1）：2631.

[8]GOESSLING W， NORTH T E， ZON L I. New waves of discovery： modeling cancer in zebrafish[J]. J Clin Oncol， 2007，25（17）：24732479.

[9]AMATRUDA J F， SHEPARD J L， STERN H M， et al. Zebrafish as a cancer model system[J]. Cancer Cell， 2002，1（3）：229231.

[10]HALDI M， TON C， SENG W L， et al. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate， migrate， produce melanin， form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish[J]. Angiogenesis， 2006，9（3）：139151.

[11]MERLINO G， KHANNA C. Fishing for the origins of cancer[J]. Genes Dev， 2007，21（11）：12751279.

[12]XIE F， CHEN H， LI J M. Application of zebrafish in cancer research[J]. China Trop Med， 2009，9（6）：11611164.

[13]PARNG C， SENG W L， SEMINO C， et al. Zebrafish： a preclinical model for drug screening[J]. Assay Drug Dev Technol， 2002，1（1）：4148.

[14]SERBEDZIJA G N， FLYNN E， WILLETT C E. Zebrafish angiogenesis： a new model for drug screening[J]. Angiogenesis， 1999，3（4）：353359.

[15]NICOLI S， RIBATTI D， COTELLI F， et al. Mammalian tumor xenografts induce neovascularization in zebrafish embryos[J]. Cancer Res， 2007，67（7）：29272931.

[16]HABECK H， ODENTHAL J， WALDERICH B， et al. Analysis of a zebrafish VEGF receptor mutant reveals specific disruption of angiogenesis[J]. Curr Biol， 2002，12（16）： 4051412.

[17]BRIDGE G， MONTEIRO R， HENDERSON S， et al. The microRNA30 family targets DLL4 to modulate endothelial cell behavior during angiogenesis[J]. Blood， 2012，120（25）：50635072.

[18]EMUSS V， LAGOS D， PIZZEY A， et al. KSHV manipulates Notch signaling by DLL4 and JAG1 to alter cell cycle genes in lymphatic endothelia[J]. PLoS Pathogens， 2009，5（10）：e1000616.

（编辑王健）