Klotho基因(rs3752472)与草酸钙结石发病风险的多态性研究

徐 伟, 蒋民军,徐 辰,宋日进, 王晓岚, 张 炜

(1.苏州市吴江区第一人民医院急诊外科, 江苏苏州 215200;2苏州市吴江区第一人民医院泌尿外科, 江苏苏州 215200;3南京医科大学第一附属医院泌尿外科, 江苏南京 210029)

·基础研究·

Klotho基因(rs3752472)与草酸钙结石发病风险的多态性研究

徐 伟1, 蒋民军2,徐 辰2,宋日进3, 王晓岚3, 张 炜3

(1.苏州市吴江区第一人民医院急诊外科, 江苏苏州 215200;2苏州市吴江区第一人民医院泌尿外科, 江苏苏州 215200;3南京医科大学第一附属医院泌尿外科, 江苏南京 210029)

目的 探讨华东地区汉族人群中Klotho基因多态性与尿路草酸钙结石发病风险的相关性。方法 纳入1 704名尿路草酸钙结石患者及1 128名健康对照者，通过TaqMan单核苷多态性基因型分析方法，对3个Klotho基因多态性位点(rs3752472、rs650439和rs577912)与尿路草酸钙结石发病风险的相关性进行比对。结果 本实验人群中Klotho基因rs3752472多态性位点CC纯合子基因型携带者尿路草酸钙结石的发病风险几乎两倍于CT杂合子基因型携带者及TT纯合子基因型携带者(95%CI=1.013～2.255,OR=1.512,P=0.043)。结论 本实验人群中Klotho基因rs3752472多态性位点与尿路草酸钙结石的发病风险显著相关，可能作为风险因子在结石的发生发展过程中起着十分重要的作用。

Klotho;氧化应激损伤;泌尿系结石;单核苷多态性

尿路结石作为泌尿系统常见疾病，由基因及环境因素共同作用形成[1]。研究证实草酸钙结石是尿路结石最常见的组成成分，其可通过氧化应激损伤作用破坏肾小管上皮细胞结构[2-3]。DAVALOS等[4]研究发现一水草酸钙通过氧化应激损伤对近端肾小管上皮细胞产生细胞毒性作用，从而降低细胞活力，最终促成了尿路结石的形成。

Klotho蛋白最初是作为抗衰老蛋白被人类所熟识[5]。Klotho表达产物有两种，除了膜型Klotho蛋白，分泌型Klotho蛋白以游离形式存在于人体的尿液，血液及脑脊液中[6]。研究证实分泌型Klotho蛋白不仅可以作为调节人体钙磷代谢的节拍器，还在抑制胰岛素/胰岛素样生长因子-1(Insulin-like Growth Factors -1,IGF-1)信号通路及氧化应激损伤方面具有重要的作用[2,7]。

综上所述，氧化应激损伤与尿路草酸钙结石的形成关系密切，而研究证实Klotho蛋白存在抗氧化作用，这三者之间是否存在着某种尚未发现的联系我们不得而知。因此，本研究将针对3个Klotho基因多态性位点(rs3752472, rs650439, rs577912)，探讨其在华东地区汉族人群中与尿路草酸钙结石发病风险的相关性。

1 材料与方法

1．1 一般资料共有1 704例草酸钙或含草酸钙结石的尿石症患者(男1 196例，女408例，平均年龄(47.7±12.0)岁被纳入本次研究，均为华东地区汉族人群。所有结石样本均来自于体外冲击波碎石后患者自行排出或经外科手术取出，且通过红外光谱分析技术进行结石成分测定，确定为单一草酸钙结石或含草酸钙结石者则纳入本次研究。设为实验组。本研究对照组由1 128例华东地区无尿路结石病史的健康汉族志愿者(男848例，女280例)，平均年龄(48.4±13.0)岁组成。

两组人群入组前均已签订知情同意书，并通过了南京医科大学附属江苏省人民医院伦理委员会审核。

1.2 研究方法收集试验组及对照组所有研究对象的血液及尿液样本进行分析，包括存在高钙血症、高草酸血症、肿瘤或甲状旁腺功能亢进等可能影响人体钙或草酸代谢的因素的研究人群均排除于此项研究。本次研究仅分析比较两组人群24 h尿钙、尿磷、血钙、血磷、血肌酐及血乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)水平变化。

将两组人群外周静脉血编号，均取10 mL，EDTA抗凝，-80°C保存备用。利用全血基因组DNA提取试剂盒提取外周血基因组DNA。基因型分析采用TaqMan探针法进行，各个SNP的探针及引物的序列均符合本次试验要求。利用ABI 7900HT 实时PCR系统进行PCR扩增。利用SDS2.4软件对各个等位基因差异进行基因分型。对不能确定基因分型进行两次或多次重复实验以确保实验数据的准确性。随机选取8%～10%(本次为10%) 的样本进行重复实验，结果均与首次分型结果一致。

1.3 统计学处理采用SPSS19.0数据统计软件，计量资料采用平均数±标准差表示。采用单因素ANOVA检验对Klotho基因型定量变量进行分析。计算各群体基因型及等位基因频率，群体间基因型及等位基因频率差别以及结石形成风险因子与Klotho基因多态性之间存在的联系用二元Logistic回归进行分析。OR值的可信区间为95%。所有统计数据检验水准定义为α<0.05为有统计学意义。

2 结 果

与对照组相比，实验组人群血钙含量及24 h尿钙浓度明显升高，差异具有统计学意义(P=0.039；P<0.000 1，表1)。然而两组间在血LDH浓度及尿pH并没有明显的区别(P=0.124；P=0.400)。试验组人群血磷水平明显低于对照组人群，且拥有更差的肾功能，差异有统计学意义(P=0.000 1；P=0.027)。

表1 本研究纳入人群资料(n=2 832)

两组比较，*P<0.05定义为有统计学差异

Klotho基因型频率在结石组和对照组均符合Hardy- Weinberg平衡定律(P>0.05)。实验组中rs3752472多态性位点C等位基因频率为0.924而T等位基因频率为0.076，而在对照组中，C与T等位基因频率分别为0.894及0.106； rs577912多态性位点(A/C)等位基因频率在实验组中为0.250/0.750，而在对照组中为0.215/0.785；而rs650439多态性位点A与T等位基因频率在实验组(0.688/0.312)与对照组(0.676/0.324)的比较中，亦未见明显统计学差异。然而，在对三个多态性位点的基因型进行分析比较时，我们发现仅rs3752472多态性位点与尿路草酸钙结石的发病风险显著相关。与CC纯合子基因型携带者相比，TT纯合子基因型及CT杂合子基因型携带者发生尿路草酸钙结石的OR值为1.512 (95%CI=1.013～2.255,P=0.043,表2)。

表2 Klotho基因多态性基因型与等位基因频率及与泌尿系结石发病风险相关性(例)

OR(odd ratio 比值比);CI(confidenceinterval 可信区间)。1:参考系 基因型/等位基因;2:CC纯合子基因型与CT +TT基因型进行分析比较;3:AA纯合子基因型与AT +TT基因型进行分析比较;4:CC纯合子基因型与AC +AA基因型进行分析比较;试验组与对照组比较时*P<0.05定义为有统计学差异。

为了探索不同Klotho基因型与尿路草酸钙结石发病危险因子之间潜在的联系，我们分别分析比较了两组人群的血磷与血钙水平、24 h尿磷与尿钙水平、血肌酐、血乳酸脱氢酶水平以及尿pH(表3)。实验组中rs577912多态性位点A等位基因携带者结石患者血钙水平明显低于CC纯合子基因型携带者，而这一差异在对照组人群中并无明显统计学意义(P=0.036))。然而，在对照组中，rs577912多态性位点A等位基因携带者血肌酐水平明显高于CC纯合子基因型携带者，该差异在试验组中却未见明显统计学差异(P=0.031)。比较 rs3752472 与 rs650439多态性位点试验组与对照组人群血钙水平，均未见明显统计学差异。

3 讨 论

作为发展中国家最常见的泌尿系疾病之一，尿路结石长久以来一直困扰着人们。尿路结石成分分析结果显示草酸钙是尿路结石中最常见的结石成分[2]。研究发现高浓度草酸或草酸盐结晶在肾小管上皮细胞内聚集可能会产生细胞毒性作用，从而破坏细胞自身结构[8]。

表3 Klotho基因不同基因型在试验组与对照组中关于结石相关临床症状的分析比较

组 别Rs3752472CCCT+TTP值Rs650439AAAT+TTP值Rs577912CCAC+AAP值实验组性别(男性/女性)1024/440172/680.787632/180564/3280.753692/284504/2240.709年龄(岁)47.8±12.447.3±12.00.77448.4±12.647.1±12.00.27146.9±12.548.8±12.00.127血钙(mg/dL)9.2±0.49.2±0.40.5389.2±0.89.2±0.40.7629.2±0.49.1±0.40.036*血磷(mg/dL)3.4±1.83.4±0.60.6413.4±0.63.4±0.60.3023.4±0.63.4±0.60.44024h尿钙(mg)239.1±145.7247.1±144.60.721226.3±141.5252.7±148.00.090238.5±148.7242.4±141.30.80024h尿磷(mg)349.5±244.2395.6±218.70.214351.7±255.5359.7±227.90.757362.4±253.6347.3±224.00.561血肌酐(μmol/L)91.2±32.493.4±29.20.80596.5±40.187.8±23.60.18192.1±32.590.7±31.20.828尿pH6.0±0.66.1±0.60.7416.0±0.76.1±0.60.3966.0±0.66.1±0.60.681乳酸脱氢酶(U/L)162.1±31.6 164.3±20.6 0.804157.6±28.6 166.0±31.3 0.176162.4±30.9 162.6±29.9 0.976组别Rs3752472CCCT+TTP值Rs650439AAAT+TTP值Rs577912CCAC+AAP值对照组性别(男性/女性)676/228172/520.756404/104444/1760.127504/200344/800.074年龄(岁)48.7±13.047.1±15.30.44247.9±12.648.9±14.10.56849.1±13.747.2±13.00.264血钙(mg/dL)9.2±0.49.2±0.40.3449.2±0.49.2±0.40.0769.2±0.49.2±0.40.439血磷(mg/dL)3.7±0.63.7±0.60.4363.7±0.63.7±0.60.5153.7±0.63.7±0.60.45024h尿钙(mg)105.4±81.4 119.0±88.7 0.80887.4±79.9135.7±82.3 0.34776.6±61.6159.5±83.8 0.06324h尿磷(mg)268.3±90.2 364.7±240.80.288255.9±109.5305.9±144.80.553271.8±101.3320.6±181.30.542血肌酐(μmol/L)81.3±25.586.5±21.90.47981.0±14.583.5±30.70.66378.0±14.191.3±37.20.031*尿pH5.9±0.26.2±0.80.1845.9±0.66.0±0.70.5045.9±0.76.2±0.60.189乳酸脱氢酶(U/L)190.0±134.5184.0±60.90.867184.8±133.4191.9±115.20.808184.1±112.5198.4±143.40.642

依据基因型比较临床症状时，*P<0.05定义为有统计学差异。

动物实验模型证实分泌型Klotho蛋白过表达可对抗氧化应激作用，对心血管-肾脏系统提供保护，使机体组织免受氧化应激损伤，最终达到延缓机体衰老过程的作用[9]。OHTA[10]等完成了大鼠模型体内实验后发现Klotho基因可上调大鼠模型体内锰超氧化物歧化酶的表达，从而达到抑制氧化应激损伤的进程。综上所述，我们猜测Klotho基因可能拥有对抗氧化应激损伤的作用。已有多项研究证实rs3752472，rs650439和 rs577912三个多态性位点与氧化应激损伤作用息息相关[11-12]，而氧化应激损伤可导致泌尿系结石的形成，因此，本次研究选择rs3752472，rs650439和 rs577912三个多态性位点，分别探讨其与尿路草酸钙结石发病风险的相关性。

我们的研究结果显示rs3752472的CC纯合子基因型携带者发生尿路草酸钙结石的风险明显高于T等位基因携带者，差异具有统计学意义 (P=0.043)。然而，研究并未发现两组人群中rs3752472等位基因频率与尿路草酸钙结石的发病风险有明显的统计学差异(P=0.087)。本研究Klotho基因多态性位点rs650439与rs577912等位基因及基因型在两组人群间比较均无显著差异(P=0.494；P=0.174)。2011年，TELCI等[13]首次报道了土耳其人群中Klotho基因多态性位点G395A与尿路结石发病风险的相关性。他们发现GG基因型携带者结石的发病风险几乎两倍于A等位基因携带者。研究同时证实不携带A等位基因的人群更易出现结石相关的临床症状，如高钙血症，低磷血症和高磷酸盐尿。

已有多项研究证实Klotho基因参与介导机体钙磷代谢，然而本次研究对于结石相关的临床症状的比较中我们仅在rs577912多态性位点上发现血钙水平的变化具有明显的统计学差异，在比较rs3752472及rs650439多态性性位点与结石相关临床症状时，我们并未发现任何有统计学意义的数据。究其原因可能与研究人群的饮食习惯以及服用药物等实验本身难以控制的干扰因素有关。

虽然rs3752472CC纯合子基因型携带者易发生尿路草酸钙结石病的原因仍未知，但根据我们的研究结果，我们推测该变异可能源于Klotho蛋白表达水平的变化。当与核内蛋白提取物结合时，rs3752472的T等位基因寡核苷酸可能较C等位基因寡核苷酸形成一个活性更高的DNA-蛋白复合体，从而导致氨基酸突变后的Klotho蛋白表达下降[14]。最终，CC纯合子基因型携带者体内Klotho蛋白表达水平降低，低于T等位基因携带者。分泌型Klotho蛋白表达水平下降激活了胰岛素/胰岛素样生长因子-1信号通路，致使FOXO转录因子(Forkhead box O, FOXO)表达水平下降，从而机体体内抗氧化应激损伤作用的辅酶表达水平下降，对机体有害的活性氧簇产生过多，最终导致肾小管上皮细胞结构因氧化应激作用遭受破坏，促进结石形成。据此，我们猜测CC纯合子基因型携带者较T等位基因携带者应具有更高的LDH水平，然而我们的实验结果发现两者的LDH水平相近，无统计学差异。

本研究发现Klotho基因rs3752472多态性位点CC纯合子基因型携带者与尿路草酸钙结石的发病风险显著相关。然而，本次研究样本量较小，仍需进一步的分子生物学研究来验证Klotho基因rs3752472多态性位点在尿路草酸钙结石形成过程中的潜在功能。

[1] MITTAL RD, BID HK, MANCHANDA PK,et al. Predisposition of genetic polymorphism with the risk of urolithiasis[J]. Indian J Clin Biochem 2008,23(2):106-116.

[2] MOE OW. Kidney stones: pathophysiology and medical management[J]. Lancet 2006,367(9507): 333-344.

[3] SCHEID CR, KOUL H, HILL WA,et al. Oxalate toxicity in LLCPK1 cells: Role of free radicals[J]. Kidney Int,1996,49:413-419.

[4] DAVALOS M, KONNO S, ESHGHI M,et al. Oxidative renal cell injury induced by calcium oxalate crystal and renoprotection with antioxidants:a possible role of oxidative stress in nephrolithiasis[J]. J Endourol,2010,24():339-334.

[5] KURO-O M, MATSUMURA Y, AIZAWA H, et al. Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageing[J]. Nature,1997,390:45-51.

[6] SHIRAKI-IIDA T, AIZAWA H, MATSUMURA Y,et al. Structure of the mouse klotho gene and its two transcripts encoding membrane and secreted protein[J]. FEBS Lett,1998,424(1-2):6-10.

[7] KURO-O M. Klotho and aging[J]. Biochim Biophys Acta,2009,1790(10): 1049-1058.

[8] KHAN SR.Calcium oxalate crystal interaction with renal tubular epithelium, mechanism of crystal adhesion and its impact on stone development[J]. Urol Res,1995,23(2):71-79.

[9] KUROSU H, YAMAMOTO M, CLARK JD,et al. Suppression of Aging in Mice by the Hormone Klotho[J]. Science,2005, 309(5742):1829-1833.

[10] OHTA J, ISHIKAWA K, YANG J,et al. Klotho gene delivery suppresses oxidative stress in vivo[J]. Geriat Gerontol Int,2007, 7(3):293-299.

[11] OGURO R, KAMIDE K, KOKUBO Y,et al. Association of carotid atherosclerosis with genetic polymorphisms of the klotho gene in patients with hypertension[J]. Geriatr Gerontol Int,2010,10: 311-318.

[12] FRIEDMAN DJ, AFKARIAN M, TAMEZ H,et al. Klotho variants and chronic hemodialysis mortality[J]. J Bone Miner Res,2009,24(11):1847-1855.

[13] TELCI D,DOGAN AU, OZBEK E,et al. Klotho gene polymorphism of G395A is associated with kidney stones[J] Am J Nephrol,2011,33: 337-343.

[14] KAWANO K, OGATA N, CHIANO M,et al. Klotho gene polymorphisms associated with bone density of aged postmenopausal women[J]. J Bone Miner Res,2002,17(10): 1744-1751.

(编辑 王 玮)

Klotho gene polymorphism of rs3752472 is associated with the risk of calcium oxalate calculi

XU Wei1, JIANG Min-jun2, XU Chen2, SONG Ri-jin3, WANG Xiao-lan3, ZHANG Wei3

(1.Department of Emergency the First People’s Hospital of Wujiang City, Wujian 215200; 2. Department of Urology, the First People’s Hospital of Wujiang City, Wujian 215200; 3. Department of Urology, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China)

Objective To investigate the possible relationship between klotho gene polymorphism and the risk of calcium oxalate urolithiasis in Han nationality in Eastern China. Methods Klotho gene polymorphism rs3752472, rs650439 and rs577912 were investigated in 1 704 patients with calcium oxalate stones and 1 128 age-matched healthy volunteers with no history of stone formation, usingTaqMan SNP Genotyping Assays. Results Significant differences were found between rs3752472 and the risk of nephrolithiasis as CC genotype of rs3752472 klotho polymorphism had almost 2-fold increased stone risk compared with the heterozygote genotype CT and homozygous genotype TT (95%CI=1.013-2.255,OR=1.512,P=0.043). Conclusions Our results showed that the rs3752472 polymorphism of klotho gene is associated with the risk of calcium oxalate urolithiasis and may act as a risk factor during stone formation in Han population.

klotho; oxidative stress; urolithiasis; polymorphism

2014-10-08

2014-11-03

徐伟(1982-)，男(汉族)，住院医师.E-mail：463161688@qq.com;蒋民军(1970-)，男(汉族)，主任医师.E-mail：13606258811@139.com,系共同第一作者。

R692.4

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2015-02-016