家蚕免疫血清体外抑制神经母细胞瘤细胞生长和增殖*

王梓任 陆天琳 徐 曼 杨丽群

(西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室，重庆 400716)

家蚕免疫血清体外抑制神经母细胞瘤细胞生长和增殖*

王梓任 陆天琳 徐 曼 杨丽群

(西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室，重庆 400716)

家蚕免疫系统在抵抗病原微生物时会产生一些具有免疫功能的小分子肽，有研究表明这些肽具有抗肿瘤活性。我们通过免疫诱导法，给家蚕注射了一定量的抗原诱导家蚕产生免疫血清。从家蚕体内收集免疫血清，稀释成不同浓度梯度处理神经母细胞瘤细胞系BE(2)C，并观察其对BE(2)C细胞的影响。通过显微镜观察发现免疫血清处理后肿瘤细胞出现了大面积死亡。经MTT方法检测分析后发现，家蚕免疫血清对肿瘤细胞生长有抑制作用。实验结果初步证实了经抗原诱导的家蚕免疫血清对神经母细胞瘤系BE(2)C的生长及增殖有抑制作用，推测家蚕免疫血清可能诱导了肿瘤细胞发生凋亡，为进一步解析其调控机制提供了有力的数据支撑，为开发家蚕新的经济用途奠定了良好基础。

家蚕；血清；神经母细胞瘤；细胞增殖

家蚕是鳞翅目昆虫的代表，在我国拥有悠久的饲养历史，同时家蚕作为一种新兴的模式生物，已经完成了家蚕全基因组图谱的测定。家蚕免疫系统在受到刺激时可以合成抗菌肽[1]，抗菌肽除了拥有广谱抗菌活性外还具有抗肿瘤活性[2]。现在发现的抗菌肽主要有天蚕素、双翅肽、攻击素、抗真菌肽和防卫素等 。现在的研究对家蚕抗菌肽抗肿瘤机理尚未解析清楚[3]，一般认为抗菌肽在水溶液中没有稳定构象，只有在接近细胞膜后才形成高级构象，并聚合形成离子通道，破坏细胞膜使细胞死亡[4]。抗菌肽对肿瘤细胞有选择性杀伤，主要原因可能是正常细胞表面的胆固醇可以阻止抗菌肽形成高级构象，而癌细胞表面缺乏胆固醇[5]，抗菌肽可以形成高级构象并进一步聚合成离子通道破坏细胞。Christense等[7]人用脂质体模型描述了抗菌肽作用于膜的过程。抗菌肽首先通过静电作用被吸引到膜表面，然后疏水性尾巴插入细胞膜中的疏水区域，改变膜的构象，最后多个抗菌肽聚合在膜上形成离子通道，破坏细胞膜的结构。

神经母细胞瘤，是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤[6]，约占所有颅内原发肿瘤的一半，多出现在幼儿时期，诱发原因复杂[8]。存在恶性程度高，预后效果差[9]，容易复发[10]，治疗手段缺乏[11]等问题。神经母细胞瘤系BE(2)C细胞是已经被鉴定的，具有肿瘤干细胞特性的细胞系[7]，具有重要的研究价值和研究意义。目前尚无关于家蚕免疫血清对神经母细胞瘤作用的研究报道。本研究基于家蚕免疫学，通过给家蚕分别注射大肠杆菌或LPS，诱导家蚕产生免疫血清，用免疫血清处理BE(2)C细胞，然后通过细胞形态学观察和MTT法验证家蚕免疫血清对BE(2)C细胞的抑制作用，为近一步研究其抗肿瘤分子机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料及主要试剂

家蚕品系大造P50由西南大学家蚕基因资源库保存。大肠杆菌DH52、神经母细胞瘤BE(2)C细胞由本实验室保存。细菌内毒素LPS、F12培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、PEN青霉素抗生素、MTT液等均购自Invitrogen公司。

1.2 家蚕免疫血清获取

(1)大肠杆菌诱导家蚕免疫血清的获得。取大肠杆菌菌液1 200r/min离心10min后弃上清，用1×PBS清洗3次，结晶紫染色并计数。取5龄3d的大造家蚕，暂停喂食5～6h后，用输液注射器每只注射2 000个大肠杆菌。注射后正常喂食桑叶。免疫诱导24h、48h后给收集血淋巴。血淋巴在3 000r/min离心5min去除血细胞，获得家蚕血清。取出的血清立即加入苯基硫脲防止血清氧化。用0.22μm孔径的滤膜过滤血清，分装后放入-20℃冰箱冷冻保存。

(2)LPS诱导家蚕免疫血清的获得。取出-20℃冷藏的LPS用1×PBS缓冲液稀释备用，根据一般LPS刺激细胞时所用的浓度，取5龄3d大造家蚕每头注射100ng，注射后正常喂食桑叶。注射24h、48h后收集血清，方法同上。

(3)对照组家蚕血清的获得。取5龄3d的大造家蚕，暂停喂食5～6h后，用输液注射器每只注射5μL的1×PBS，注射后正常喂食桑叶。注射24h、48h后收集血清，方法同上。

1.3 显微镜观察比较家蚕免疫血清对肿瘤的作用

在直径100mm的培养皿中培养BE(2)C细胞，直到细胞增殖至对数生长期。吸出培养基，用1×PBS反复清洗3遍，加入8ml分别含有10%通过不同方法免疫后产生的家蚕免疫血清的DMEM12培养基。对照组每盘加入8ml注射PBS后取得的家蚕血清用同样方法配置成终浓度10%的培养液。正常培养12h后显微镜观察肿瘤细胞形态变化及生长情况。

1.4 MTT法检测家蚕免疫血清对肿瘤增殖的抑制

将贴壁生长并处于对数生长期的BE(2)C细胞用胰蛋白酶消化，800r/min离心5min，弃上清，用DMEF12培养基重悬，加入到96孔细胞培养板中，每孔1 000个细胞，于37℃、5% CO2孵箱中过夜培养。次日，吸出每孔中的培养基，用PBS洗涤3次。实验组Ⅰ将大肠杆菌诱导的家蚕免疫血清用DMEF12完全培养基按梯度配置成家蚕血清终浓度为2%、5%和10%的培养液，每种浓度重复5孔，每孔加入100μL处理。实验组Ⅱ将LPS诱导的家蚕免疫血清用同样方法稀释成终浓度为2%、5%和10%的培养液，每种浓度重复5孔，每孔加100μL处理。对照组将注射PBS后取得的家蚕血清用同样方法配置成家蚕血清终浓度为2%、5%和10%的培养基，每种浓度重复5孔，每孔加入100μL处理。同时设置调零孔 (加入200μL完全培养基, 不含细胞 )。家蚕血清与肿瘤细胞作用12h后每孔加20μL MTT溶液终止，于37℃温箱温育4h，取出置于常温水平摇床摇30min，之后于560nm处检测其吸光值。采用GraphPad Prism进行统计分析，并进行方差分析，绘制柱状图。

2 结果与分析

2.1 血清处理BE(2)C细胞后显微镜观察

在对用不同家蚕血清处理后肿瘤细胞的显微镜观察。对照组用正常家蚕血清分别处理24h，48h，在显微镜下可以观察到对照组(48h未展示)BE(2)C细胞形态正常，边界明显，生长状况良好。实验组分别使用大肠杆菌诱导家蚕免疫血清和LPS诱导家蚕免疫血清处理肿瘤细胞24h和48h。显微镜观察显示(48h图片未展示)的BE(2)C细胞结构塌陷，边界模糊，生长状况不好，同时在观察时还发现有大量细胞处于悬浮状态，有可能是因为家蚕免疫血清诱导肿瘤细胞凋亡所致。另外，LPS诱导免疫血清处理后BE(2)C细胞数量明显少于大肠杆菌诱导免疫血清处理后的BE(2)C细胞，观察结果提示LPS诱导免疫血清抗肿瘤活性可能优于大肠杆菌诱导免疫血清。

显微镜观察的结果显示LPS诱导的家蚕免疫血清和大肠杆菌诱导的家蚕免疫血清对肿瘤细胞BE(2)C都有杀伤作用，且LPS诱导的免疫血清抑瘤效果可能优于大肠杆菌诱导的免疫血清，但需要进一步实验证明。

图1 不同家蚕血清处理BE(2)C细胞后显微镜观察

2.2 MTT法检测家蚕免疫血清对BE(2)C细胞的抑制效率

根据显微镜下细胞形态学观察的结果，进一步进行MTT实验，检测家蚕免疫血清对肿瘤细胞生长的作用效果。结果显示(48h诱导免疫血清数据未展示)与对照组相比，大肠杆菌免疫血清组从浓度为2%处开始就产生了对神经母细胞瘤细胞系BE(2)C细胞增殖的抑制作用。当血清浓度升高后，正常血清对肿瘤细胞仍然没有作用，免疫血清组的BE(2)C细胞增殖仍受到抑制。

用浓度梯度为2%、5%和10%的LPS诱导家蚕免疫血清处理BE(2)C细胞，在低浓度2%处即出现对肿瘤细胞增殖的抑制，并且随着免疫血清浓度的提高，其对BE(2)C细胞增殖的抑制作用越发显著。与对照组相比，血清浓度在10%时对BE(2)C细胞生长抑制效果极显著。

MTT实验说明，通过不同免疫方法得到的血清都可以抑制BE(2)C细胞增殖，且大肠杆菌免疫血清对BE(2)C细胞的抑制不具有浓度依赖性，但是LPS免疫血清对BE(2)C细胞的抑制随着免疫血清浓度的增加而效果变得更为显著。在10%浓度的情况下LPS诱导的免疫血清抑制效果极显著，而大肠杆菌诱导的免疫血清抑制效果为显著，所以总体来看LPS诱导的家蚕免疫血清对肿瘤增殖的抑制效果优于大肠杆菌诱导的免疫血清。

图2 不同免疫血清对BE(2)C细胞增殖的抑制作用

3 讨论

神经母细胞瘤是发生于神经外胚叶组织的肿瘤，占所有颅内肿瘤的40%～50%[12]。具有高发病率、高复发率、高病死率和低治愈率“三高一低”的特点，所以寻求一种安全有效的抗神经母细胞瘤药物成为当务之急。本实验采用免疫诱导的方法诱导家蚕产生免疫血清，根据已有报道，经免疫诱导后的家蚕血清含有抗菌肽，且抗菌肽对肿瘤有抑制效果[13-15]。本实验是利用家蚕免疫系统的特性，注射对家蚕本身无害，但同时具有高免疫原性的物质大肠杆菌及LPS，刺激家蚕发生免疫应答，从而获得家蚕免疫血清。分别使用一定浓度的家蚕免疫血清和正常家蚕血清处理神经母细胞瘤细胞系BE(2)C，12h后发现家蚕免疫血清可以抑制BE(2)C细胞生长，而正常家蚕血清对细胞生长无明显影响。MTT法进一步验证，经大肠杆菌及LPS免疫诱导的家蚕血清对BE(2)C细胞生长都有明显抑制作用， 且LPS诱导的家蚕免疫血清对BE(2)C的抑制作用随免疫血清浓度升高而变强，终浓度为10%的LPS免疫诱导的家蚕血清对BE(2)C增殖能力抑制最为显著。本文验证了家蚕免疫血清可以抑制神经母细胞瘤细胞系BE(2)C的生长及增殖。目前研究报道的诱导家蚕产生抗菌肽的方法主要是用沾有细菌的针刺伤家蚕，这种方法比较粗犷，无法控制每次进入家蚕体内细菌的数量，可重复性低。本实验采用的方法是将抗原物质溶解于PBS中，从体壁注射到家蚕体内，这样每次试验注入家蚕的抗原量一定，实验具有较好的可重复性。

另外，经家蚕免疫血清处理后的BE(2)C细胞生长受到抑制的同时，还出现了细胞皱缩，边界模糊，贴壁能力下降等现象。但是家蚕免疫血清是否能够诱导肿瘤细胞发生凋亡的，还有待进一步的研究。

本文验证了经抗原诱导的家蚕免疫血清对神经母细胞瘤系BE(2)C的生长及增殖有抑制作用，推测家蚕免疫血清可能诱导了肿瘤细胞发生凋亡，为进一步解析其调控机制提供了有力的数据支撑，为开发家蚕新的经济用途奠定了良好基础。

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Silkworm immune serum inhibits the growth and proliferation of neuroblastoma cell in vitro

WANG Zi-ren，LU Tian-lin，XU Man，YANG Li-qun

(StateKeyLaboratoryofSilkwormGenomeBiology，SouthwestUniversity，Chongqing400716，China)

Silkworm immune system produce some immuno-competent micromolecule peptide when they are resisted by microbial pathogens. Recently researches indicated that those micromolecule peptide had antibiotic and antitumor activities.. We inject a certain amount of antigen to induce silkworms produce immune serum. We collect the immune serum from the injected silkworm, and dilute it into different concentration gradient to treat neuroblastoma cell line BE(2)C, and observe the effect of the serum on BE(2)C cells. By microscopic observation, we found that there is a large amount of cells dead after the treatment of immune serum. Detected by MTT analysis, the silkworm immune serum has inhibitory effect on tumor cell growth. The experimental results confirmed that the antigen induced silkworm immune serum inhibited the growth and proliferation of neuroblastoma cell line BE(2)C, speculated that the silkworm immune serum could induce apoptosis of tumor cells, provides a powerful data support for further analysis of the regulation mechanism, which lay a good foundation in developing a new economic purposes of silkworm.

Bombyxmori；Serum；Neuroblastoma；Cell proliferation

*资助项目：国家级大学生创新创业训练计划(No.201410635047)，国家自然科学基金(No.81201551),西南大学基本科研业务费(No.XDJK2013B020)。

王梓任(1993-)，男，本科生。E-mail：wzrforsci@sina.com陆天琳，(1993-)，女，本科生。E-mail：applelt11993@gmail.com

杨丽群，教授，博士生导师。E-mail:cysylq@swu.edu.cn