RP-HPLC测定六味五灵片中齐墩果酸和连翘苷的含量*

黄志恒

(河南省中医药研究院附属医院药剂科，河南 郑州 450004)

·药学研究·

RP-HPLC测定六味五灵片中齐墩果酸和连翘苷的含量*

黄志恒

(河南省中医药研究院附属医院药剂科，河南 郑州 450004)

目的：建立六味五灵片中齐墩果酸和连翘苷的含量测定方法。方法： 采用HPLC法，DiamonsilC18柱(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，测定齐墩果酸的流动相为甲醇-2g/L磷酸水溶液(80∶20)，流速1.0mL/min，检测波长205nm，柱温25 ℃；测定连翘苷的流动相为乙腈-水(25∶75)，流速1.0mL/min，检测波长277nm，柱温25 ℃。结果：齐墩果酸和连翘苷的线性范围分别为0.6～1.2μg和0.143 7～2.874 0μg，平均回收率分别为99.34%(RSD=1.53%)和100.16%(RSD=0.68%)。结论：建立的含量测定方法重复性好、简单易行，适用于六味五灵片的质量控制。

六味五灵片；齐墩果酸；连翘苷/含量测定；高效液相色谱法

六味五灵片由五味子、连翘、女贞子、莪术、苣荬菜和灵芝孢子粉6味中药构成，具有活血解毒、滋肾养肝等功效[1-3]，临床上多用于治疗慢性乙型肝炎和肝硬化等症[4-5]。现以方中女贞子的有效成分齐墩果酸和连翘有效成分连翘苷为指标，进行高效液相色谱法含量测定，为该复方的质量评价提供参考。

1 药品、试剂与仪器

六味五灵片(批号 080705，081105，090702)，山东世博金都药业有限公司产品。连翘苷对照品(批号110821-201112)、齐墩果酸对照品(批号110709-200304)，均由中国药品生物制品检定所提供，五氧化二磷减压干燥12h以上；甲醇为分析纯，天津四友精细化学品有限公司产品；乙腈为色谱纯，FisherScientific公司产品；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。日本岛津高效液相色谱仪(LC-20ATVP泵，SPD-20AVP紫外检测器，CTO-20A柱温箱，SIL-20A自动进样器)，日本岛津公司产品；DT-100 电子分析天平，北京光学仪器厂产品；SHZ-D(Ⅲ)型循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司产品；MIL-LI-QB纯净水发生器，美国MILLIPORE公司产品；DL-360A超声清洗机，上海之信仪器有限公司产品。

2 方法与结果

2.1 齐墩果酸的含量测定

2.1.1 色谱条件与系统适用性实验

DiamonsilC18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇-2g/L磷酸水(80∶20)，流速1.0mL/min，检测波长205nm，柱温25 ℃。在该色谱条件下，理论板数按齐墩果酸峰计算，应不低于2 000。

2.1.2 对照品溶液的制备

取齐墩果酸对照品适量，精密称定，加甲醇溶解制成质量分数为0.64g/L的溶液，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备

取六味五灵片10片，刮去糖衣，研细；取约1g，精密称定，置50mL具塞三角瓶中；精密加入25mL乙醇，称定质量；超声处理60min，放冷；再称定质量，加乙醇补足减失的质量；摇匀；用0.22μm滤膜滤过，即得。

2.1.4 阴性对照溶液的制备

按处方量制备不含女贞子的阴性对照药，按2.1.3方法进行处理，得到缺女贞子阴性对照溶液。

2.1.5 专属性试验

精密吸取供试品溶液、对照品溶液及缺女贞子阴性对照溶液各20μL，注入高效液相色谱仪。结果：在缺女贞子阴性对照品色谱图中，在与对照品和供试品保留时间处没有相应的色谱峰检出。表明：其他组分对齐墩果酸无干扰。见图1。

A.对照品；B.供试品；C.缺女贞子阴性对照品；1.齐墩果酸图1 齐墩果酸HPLC色谱图

2.1.6 线性关系考察

按2.1.1的色谱条件，分别精密注入1，2，4，8，10，20μL对照品溶液进行测定，以进样量(X)为横坐标，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归计算，得回归方程为Y=2.1×104X+4.1×103，r=0.999 1。结果表明:在0.64～12.8μg范围内齐墩果酸质量浓度—峰面积的线性关系良好。

2.1.7 精密度试验

取齐墩果酸对照品溶液连续进5次，每次20μL，测定峰面积。结果：峰面积的RSD值为1.35%。结果表明：精密度良好。

2.1.8 重复性试验

取六味五灵片样品5份，按2.1.3方法制备成供试品溶液，按2.1.1色谱条件测定，计算出齐墩果酸的平均含量为1.37mg/g，RSD值为1.62%。结果表明：该法重复性良好。

2.1.9 加样回收率试验

取已知齐墩果酸含量为含1.37mg/g的六味五灵片约0.5g，共9份，分为3组并精密称定质量，分别加入0.64g/L的齐墩果酸对照品0.8，1.0，1.2mL，按照2.1.3方法制备加样供试品溶液，按2.1.1色谱条件进行测定。结果：齐墩果酸的平均加样回收率为99.34%，RSD为1.53%。见表1。

表1 齐墩果酸加样回收率试验结果 n=9

2.2 连翘苷的含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性实验

DiamonsilC18色谱柱(250mm× 4.6mm，5μm)，流动相为乙腈-水(25∶75)，检测波长为277nm，柱温25 ℃，流速1.0mL/min。在该色谱条件下，理论塔板数按连翘苷峰计算应不低于2 000。

2.2.2 对照品溶液的制备

精密称定连翘苷对照品，加甲醇制成质量分数为14.37mg/L的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备

取六味五灵片10片，刮去糖衣，研细，取约1g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，加入25mL甲醇，精密称量质量，超声处理60min，放冷，再称定质量，加甲醇补足减失的质量，摇匀，用0.22μm滤膜滤过，即得。

2.2.4 阴性对照溶液的制备

按处方量制备不含连翘的阴性对照药，按2.2.3方法进行处理，得缺连翘阴性对照溶液。

2.2.5 专属性试验

精密吸取供试品、连翘苷对照品及缺连翘阴性对照溶液各10μL，进样测定。结果：在缺连翘阴性对照溶液色谱图中，在与对照品和供试品保留时间处没有相应的色谱峰出现。由此表明：其他组分对连翘苷测定时无干扰。见图2。

A.对照品；B.供试品；C.缺连翘阴性供试品；1.连翘苷图2 连翘苷HPLC色谱图

2.2.6 线性关系考察

按2.2.1色谱条件，分别以1，2，4，8，10，20μL自动进样，以进样量(X)为横坐标，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归计算，得回归方程为Y=6.413 26×105X+2.801 5×104，r=0.999 3。结果表明：在0.014 37～0.287 40μg范围内连翘苷质量分数—峰面积的线性关系良好。

2.2.7 精密度试验

取连翘苷对照品溶液进样5次，每次10μL，测定峰面积。结果：峰面积的RSD值为1.06%。结果表明：精密度良好。

2.2.8 重复性试验

取六味五灵片样品5份，按2.2.3项方法制备成供试品，按2.2.1色谱条件测定，计算出连翘苷的平均含量为48.3μg/g，RSD值为1.76%。结果表明：该法重复性良好。

2.2.9 加样回收率试验

取已知连翘苷含量为48.3μg/g的六味五灵片约0.5g，共9份，精密称量其质量，分别加入14.37mg/L的连翘苷对照品1.4，1.7，2mL，按照2.2.3方法制备加样供试品溶液，按2.2.1色谱条件进行测定。结果：连翘苷的平均加样回收率为100.16%，RSD为0.68%。见表2。

表2 连翘苷加样回收率试验结果 n=9

2.3 样品的测定

取3批六味五灵片(批号080705，081105，090702)，每批取6份，按照以上制备方法及色谱条件测定，记录色谱峰面积并计算，测定结果见表3。

表3 六味五灵片样品含量测定结果

3 讨 论

3.1 流动相的考察

齐墩果酸及连翘苷均考察了乙腈-水溶液、乙腈-2g/L磷酸水溶液、甲醇-水溶液，甲醇-2g/L磷酸水溶液等不同流动相条件，结果显示齐墩果酸用乙腈-2mL/L磷酸水溶液(80∶20)、连翘苷用甲醇-水(25∶75)做为流动相时效果最佳，色谱峰峰型及分离度均良好，且保留时间适宜，故选择上述溶液比例作为流动相。

3.2 提取方法的考察

六味五灵片的常用提取方法是回流提取和超声提取[6]。本文分别对超声提取和回流提取进行了操作比较，结果显示：超声提取和回流提取的效果差别不大，但因为超声提取方便快捷，所以选择超声提取工艺。

六味五灵片因其良好的疗效被广泛应用于临床[7]。本文采用HPLC法对六味五灵片中的连翘苷和齐墩果酸进行含量测定，可更准确地对药物中的连翘和女贞子提取物进行质量评价和控制，有利于生产管理及产品质量保证。所建立的六味五灵片中连翘苷和齐墩果酸的含量测定方法专属性、灵敏度及重现性均良好，可作为六味五灵片中齐墩果酸和连翘苷的含量测定方法。

[1]李广明,周凤蕊,刘俊华,等.六味五灵片治疗乙型肝炎肝纤维化42例[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(21):276-279.

[2]陈正国.六味五灵片联合阿德福韦酯治疗慢性乙型肝炎临床疗效观察[J].中国肝脏病杂志：电子版,2011, 3(1):12-14.

[3]高爱华,王新丽,姜清河,等.六味五灵片联合恩替卡韦治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者的疗效观察[J].中国肝脏病杂志：电子版,2011,3(1):35-37.

[4]刘方军.六味五灵片联合替比夫定治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎疗效观察[J].实用肝脏病杂志,2014,17(3):305-306.

[5]申春明,张宝莉,李艳.六味五灵片联合恩替卡韦治疗乙型肝炎肝硬化的临床观察[J].中国医学工程,2014,22(5):60.

[6]刘宏明,徐楠楠,聂磊.指纹图谱分析结合多指标成分定量用于六味五灵片的质量评价[J].中国中药杂志,2014,39(10):1816-1821.

[7]韩军,苏淑慧,王春平,等.六味五灵片治疗慢性肝损伤的临床研究[J].中西医结合肝病杂志,2007,17(5):266-267.

(编辑 陶 珠)

1001-6910(2015)02-0070-03

R

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.02.32

河南省教育厅自然科学研究计划项目(2009A360013)

2014-09-22；

2014-11-24