基因敲出猪器官移植研究进展

刘莲莲　杨海莹　张应龙　（①山东商业职业技术学院　山东 济南　250103②国家农产品现代物流工程技术研究中心　山东 济南）

基因敲出猪器官移植研究进展

刘莲莲①②杨海莹①②张应龙①②（①山东商业职业技术学院山东 济南250103②国家农产品现代物流工程技术研究中心山东 济南）

据统计，美国每年有6.3万多病人需要接受器官移植，而可供移植的器官却只有约2万多；我国每年大约有10万人需要器官移植，然而能找到供体器官的仅有约2000人，器官不足较西方国家更为突出。为有效缓解器官供需间日益突出的矛盾，异种器官移植作为解决供者器官不足的重要战略之一，近年来再次得到广泛关注和深入研究［1］。

1　器官移植的排斥反应及机理

当灵长类动物的器官异种移植给人类时，会发生几种机制不同的免疫排斥反应：（1）超急性排斥反应（HAR）：被移植的器官，在5min内就会变黑，坏死，其机理是灵长类动物的细胞表面，含有一种被成为半乳糖的物质。在长期的生命进化中，这种物质在灵长类包括人中已经消失，但存在于所有猪的血管内皮的表面，这种半乳糖被称之为G抗原；G抗原激活了病人体内的补体系统，最终导致移植物的坏死；此外，供者组织细胞表面的补体调节蛋白与人补体成分不协同，不能抑制人补体激活及其溶细胞作用，这也是发生超急性排斥反应（HAR）的原因之一。（2）急性体液性异种排斥反应（AHXR）：由于异种抗原刺激受者免疫系统，产生诱生抗体，继而导致补体依赖的细胞毒作用，病理特点为移植物血管内皮细胞严重受损并伴有DIC，镜下表现为内皮损伤，血管内血栓形成［2］。

2　猪器官移植的研究

（1）有学者开发了可表达人类补体调节蛋白（CRP）的转基因猪，如人衰变加速因子（hDAF，CD55），膜辅蛋白（MCP，CD46），膜反应性溶破抑制因子（CD59）和C1酯酶抑制剂（C1-INH）［3］。尽管利用亲和吸附技术和繁育转基因猪表达人类补体调节蛋白的方法可以使受体体内Gal抗体暂时去除，然而，异种天然抗体（XNA）的再生成以及残留的补体活性最终可导致超急性排斥反应（HAR）。（2）另一种方法是繁育α-1，3半乳糖基因敲除的猪来去除细胞表面的半乳糖，解决超急性排斥反应（HAR）。Lai等和Dai等采用基因打靶和体细胞核转移相结合技术，成功地获得了杂合的α-1，3半乳糖转移酶基因敲除猪［4-5］。Phelps等利用2次循环基因敲除和克隆技术成功繁育出纯合的α-1，3半乳糖转移酶基因敲除猪［6］。人们利用基因修饰猪进行了包括肾脏、心脏、肝脏和肺脏在内的实质脏器的异种移植并取得了一定成果。Zaidi等［7］进行了13例猪-猕猴肾移植，其中7只为人衰变加速因子（hDAF）转基因猪肾，6只对照，术后猕猴均进行了免疫抑制治疗，结果实验组平均成活时间为13d，对照组平均成活时间为6.5d。Yamada等［8］将α-1，3-半乳糖苷转移酶基因敲除（GT-KO）的猪的肾移植到免疫抑制的狒狒的体内，存活了83d克服了超急性血管排斥。不过Chen［9］报道的结果并不乐观，由于受体内出现抗-非α-半乳糖抗原-抗体，导致急性体液性排斥反应，使受体出现消耗性凝血病。2004年Kuwaki等人［10］将α-1，3-半乳糖苷转移酶基因敲除（GT-KO）的猪的心脏移植到狒狒的体内，存活了2～6个月，避免了超急性排斥反应的发生，而移植物失活是由于微循环血栓形成导致血管闭塞和周围组织缺血所引起。凝血功能障碍与早期移植物功能失活密切相关。在α-1，3-半乳糖苷转移酶基因敲除（GT-KO）猪基础上转抗凝蛋白基因如TFRI或CD39有望解决这一问题。

3　小肠移植的研究

（1）小肠移植是指将一定长度或全部的异体小肠通过血管吻合、肠道重建的方式移植给因解剖和（或）功能性原因导致小肠解剖结构缺如和（或）消化、吸收功能丧失，需要依靠营养支持来维持生命的患者，通过免疫抑制剂等一系列治疗使移植肠在患者体内有功能存活，并依靠小肠维持患者生命，甚至恢复劳动力的医疗技术。小肠移植的适应症如下：①短肠综合征引起的小肠功能衰竭；②肠蠕动失调征；③先天性肠表皮粘膜疾病；④血管性疾病、肠扭转、外伤等造成小肠坏死、施行广泛小肠切除而发生的短肠综合征、Gardner综合征、放射性小肠炎、Crohn病、坏死性小肠结肠炎等。短肠综合征是单独小肠移植的最常见原因［11］。（2）小肠移植在大器官移植中是难度最大、发展最缓慢的器官移植之一。首例临床小肠移植于1964年实施，受者为一例婴儿，供者为其母亲，术后12h死亡［12］。此后，加拿大、美国、法国、德国等国家相继开展，最长时间存活仅6个月。主要原因是移植后可发生强烈的排斥反应、移植物抗宿主反应和严重的感染，这一切是因为小肠器官本身的结构特点决定的。小肠属于空腔脏器，有丰富的肠系膜淋巴结、集合淋巴结，以及肠粘膜固有层中含有大量的淋巴组织，肠腔内有大量的微生物聚集，肠上皮细胞表面表达组织相容性抗原Ⅱ类分子等，这些特点决定了小肠移植较其他实质性脏器的移植更容易发生强烈的排斥反应及移植物抗宿主反应和严重的感染。20世纪80年代，免疫抑制剂环孢素A的应用使小肠移植进入临床起初阶段；进入20世纪90年代中期，免疫抑制剂他克莫司（FK560）应用为小肠移植开辟了新纪元；21世纪初抗胸腺球蛋白或CD52单克隆抗体诱导加他克莫司能有效控制排斥反应，全球小肠移植数量逐渐增多［13］。目前先进的小肠移植中心移植后患者和移植脏器1年存活率分别达到92%和89%［14］。随着小肠移植在临床的广泛开展，供肠来源也会象肾、心、肝脏移植一样严重缺乏，异种移植将可能是解决供求矛盾的办法。（3）曾有学者进行了小肠异种移植的研究，发现受体对移植物产生严重的超急性排斥反应［15-17］，但有关利用基因修饰猪进行小肠异种移植的研究尚未报道，为此本实验将以α-1，3半乳糖基因敲除猪为供体，将节段性小肠移植到狒狒体内，建立α-1，3半乳糖基因敲除猪-狒狒小肠移植的动物实验模型，应用抗胸腺球蛋白诱导加他克莫司抑制排斥反应，观测小肠移植物的存活情况，检测能否克服超急性排斥反应，阐明移植物失活的原因，初步探讨小肠异种移植免疫排斥机理及解决策略，为小肠异种移植的临床应用建立实验基础。

参考文献

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［5］ Dai YD，Vaught TD，Boone J，et al.Targeted disruption of α1，3-galactosyltransferase gene in cloned pigs.Nat biotechnol.2002，20:251-255.

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中图分类号：S828.1

文献标识码：A

文章编号：1007-1733（2015）01-0081-02

收稿日期：（2014-10-28）