miR-137基因转染对人眼葡萄膜黑色素瘤细胞侵袭能力的影响及机制

陈俊杰，郑娜芬，叶梓莹，林俊汕，区瑞章，曾宇婷

(1增城市人民医院，广东增城511300；2中山大学孙逸仙纪念医院)

miR-137基因转染对人眼葡萄膜黑色素瘤细胞侵袭能力的影响及机制

陈俊杰1，郑娜芬2，叶梓莹2，林俊汕2，区瑞章2，曾宇婷2

(1增城市人民医院，广东增城511300；2中山大学孙逸仙纪念医院)

目的 探讨miR-137基因转染对人眼葡萄膜黑色素瘤细胞系M23细胞侵袭能力的影响及其机制。方法 将正常培养的M23细胞分为转染组和对照组，每组3孔，分别采用LipofectamineTM2000 瞬时转染miR-137 mimic及miR-137 mimics 阴性对照。转染18 h后用Transwell侵袭试验检测两组细胞侵袭能力(穿膜细胞数)；48 h后采用Western blot法检测细胞基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9表达，采用ELISA法检测细胞培养上清液中MMP-2和MMP-9水平。结果 转染组穿膜细胞数明显少于对照组(P均<0.05)； MMP-2和MMP-9蛋白表达低于对照组(P均<0.05)；细胞培养上清液中MMP-2和MMP-9水平低于对照组(P均<0.05)。结论 miR-137基因转染对M23细胞的侵袭能力有抑制作用；其机制可能为抑制细胞MMP-2和MMP-9表达。

葡萄膜黑色素瘤；侵袭；miR-137基因；基质金属蛋白酶

葡萄膜黑色素瘤是最常见的成人眼内恶性肿瘤，具有非常高的侵袭及转移能力[1,2]。但对其发病机制的研究较少[3]。葡萄膜黑色素瘤具有极高的血行转移概率，其中以肝转移最常见，约占了全部转移的90%以上，病死率很高[4]。微小RNA(miRNA)近年来成为生命科学特别肿瘤领域研究的热点。研究发现，miRNA在人眼葡萄膜黑色素瘤发生和发展过程中起重要作用[5,6]。我们前期研究显示上调miR-137表达能抑制人眼葡萄膜黑色素瘤细胞系M23的增殖和迁移能力[7]。2014年1～7月，我们观察了miR-137基因转染对人葡萄膜黑色素瘤M23细胞侵袭能力的影响，现分析结果并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人眼葡萄膜黑色素瘤细胞系M23购自ATCC；miR-137 mimics及对应的miR-137 mimics 阴性对照由上海吉玛公司设计并合成；荧光标记的随机序列RNA由美国Ambion公司合成；胎牛血清和RPMI 1640培养基购自美国HyClone公司；Opti-MEM培养基和LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；8.0 μm孔径PC膜Transwell小室购自美国Corning公司；细胞外基质(ECM)胶购自美国Sigma公司，RPMI-1640 培养基(无酚红)购自北京寰宇科创生物科技公司；MMP-2和MMP-9 ELISA检测试剂盒、辣根酶标记抗兔IgG购自武汉博士德生物；兔抗MMP-2及MMP-9单克隆抗体、兔抗GAPDH多克隆抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology； SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、ECL反应检测试剂盒和总蛋白提取试剂盒购自碧云天生物技术研究所；蛋白浓度检测试剂盒购自南京凯基公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞分组及转染 取对数期M23细胞胰酶消化制成细胞悬液，接种于6孔板，每孔3.5×105个细胞，接种后20 h细胞生长良好时分为转染组和对照组，每组3个复孔；分别通过LipofectamineTM2000采用miR-137 mimics、miR-137 mimics 阴性对照组瞬时转染。转染终浓度均为30 nmol/L。同时转染荧光标记的随机序列RNA以观察转染效率。转染方法按照minR-137 mimics说明书操作。

1.2.2 细胞侵袭能力检测 采用Transwell侵袭试验。Transwell小室上室面铺上ECM胶制备Transwell侵袭模型小室。两组转染18 h时胰酶消化制备成细胞悬液，细胞浓度调整为2×105/mL，上室加入细胞悬液200 μL，下室加入含10%胎牛血清的完全培养基500 μL，置37 ℃、50 mL/L CO2培养箱。30 h后取出小室，甲醇固定后苏木素将膜浸泡染色，显微镜下观察膜的下室面，随机选取10个200倍视野计数每个孔穿过膜的细胞数量(穿膜细胞数)。

1.2.3 MMP-2、MMP-9蛋白表达检测 ①细胞MMP-2、MMP-9蛋白表达：采用Western blot法。转染48 h收集两组细胞，按照全蛋白提取试剂盒说明书操作提取蛋白，采用蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白浓度，每条泳道加40 μg蛋白进行等质量上样，SDS-PAGE电泳，湿转法转膜，一抗MMP-2和MMP-9以1∶1 000稀释使用，4 ℃孵育过夜，二抗IgG(稀释度1∶5 000)室温孵育1 h，洗膜后ECL化学发光法检测，GAPDH为内对照。显像图用Image J 软件进行分析。用软件读取各条带灰度值，然后将各组待检测蛋白条带灰度值与相应内对照条带灰度值进行相比，即为相对蛋白表达量。②细胞培养上清液MMP-2、MMP-9蛋白水平：采用ELISA法。细胞转染后18 h换液，改用不含血清的无酚红RPMI 1640培养基，培养30 h后离心收集上清，按ELISA检测说明书检测分泌型MMP-2和MMP-9含量, 重复3次。相对表达量按照说明书进行计算。

2 结果

将荧光标记的随机序列RNA 转染M23细胞，24 h在荧光显微镜下观察，基本上所有细胞均有荧光显示，说明转染效率接近100%。

2.1 细胞侵袭能力 转染组、对照组穿膜细胞数分别为(30.25±8.71)、(103.38±11.69)个，转染组明显少于对照组(P<0.05)。

2.2 细胞MMP-2、MMP-9蛋白表达 转染组MMP2和MMP-9蛋白相对表达量分别为0.157±0.033和0.208±0.051，对照组分别为0.892±0.040和0.969±0.032，转染组均低于对照组(P均<0.05)。

2.3 细胞上清液中MMP-2、MMP-9水平 转染组细胞上清液中MMP-2和MMP-9表达量分别为0.663±0.033和0.854±0.059，对照组分别为1.618±0.021和1.730±0.084，转染组均低于对照组(P均<0.05)。

3 讨论

人眼葡萄膜黑色素瘤是成人最常见的眼内原发性恶性肿瘤，其除皮肤外第二常见的原发性恶性黑素瘤[8]。葡萄膜黑色素瘤具有极高的转移能力，大多数患者在诊断时往往已发生亚临床转移[9]。迄今为止，葡萄膜黑色素瘤的病因尚未被阐明，临床上对其缺乏有效治疗方法，且治疗标准尚未统一。由于葡萄膜黑色素瘤生长和播散的机制不明，对发生转移的葡萄膜黑色素瘤更加缺乏有效的治疗手段[10]。探讨葡萄膜黑色素瘤侵袭、转移的分子机制，寻求新的治疗靶点，对葡萄膜黑色素瘤的防治具有重大意义。

miR-137在多种物种间具有高度保守性，已证实在多种肿瘤组织中其表达减低，扮演着抑癌基因的角色。文献报道，在miR-137表达减低的肿瘤细胞中恢复其表达后，细胞增殖、侵袭和转移的能力均受到明显抑制[11～13]。在人眼葡萄膜黑色素瘤中，miR-137表达减低且上调其表达可以抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖、多克隆形成和动物体内的肿瘤形成能力，认为是葡萄膜黑色素瘤的抑癌基因[14]。我们前期研究显示上调miR-137表达能抑制人眼葡萄膜黑色素瘤细胞系M23的增殖和迁移能力[7]。本研究结果显示，转染miR-137基因后葡萄膜黑色素瘤细胞M23细胞的侵袭能力受到明显抑制，进一步证实miR-137是葡萄膜黑色素瘤的抑癌基因。

肿瘤细胞发生转移的前期条件是细胞获得侵袭能力。细胞发生侵袭时失去黏附能力而变得松散利于游走，侵入细胞外基质(ECM)并分泌MMPs降解ECM，使基底膜产生局部缺损，肿瘤细胞穿过这些缺损处进入血管，通过血管在远处定植，形成转移灶[15]。肿瘤细胞分泌的MMPs中，MMP-2和MMP-9是降解ECM的最主要成分，它们在肿瘤新生血管形成、肿瘤细胞侵袭和转移灶的形成过程中均起重要作用[16,17]。MMP-2和MMP-9在葡萄膜黑色素瘤组织中的分泌水平增加[18]，它们的表达与葡萄膜黑色素瘤侵袭和转移具有密切的相关性，两者分泌表达增加预示着患者预后不良[19～22]。体外实验显示葡萄膜黑色素瘤细胞在恶性特征逆转后，MMP-2等分泌和表达会受到抑制[23]。本研究结果显示转染组M23细胞内MMP-2、9蛋白表达和胞外MMP-2、9分泌水平低于对照组，提示miR-137可能通过减低MMP-2和MMP-9表达而抑制人眼葡萄膜黑色素瘤细胞的侵袭能力。

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Effect of miRNA-137 transfection on human uveal melanoma cell line invasion

CHENJun-jie1,ZHENGNa-feng,YEZi-ying,LINJun-shan,OURui-zhang,ZENGYu-ting

(1People′sHospitalofZengchengCity,Zengcheng511300,China)

Objective To investigate the effects of miR-137 gene transfection on human uveal malignant melanoma cell lines M23. Methods miR-137 mimics were transfected to M23 by Lipofectamine package LipofectamineTM2000. Cell invasion was detected by transwell invasion assay 18 h after transfection. MMP-2 and MMP-9 proteins expression were investigated by Western blot and ELISA. Results Transwell invasion assay showed that the number of M23 cells in miR-137 mimics group was significantly lower than negative control group. Western blot and ELISA confirmed that miR-137 mimics could significantly inhibit the expressions of MMP-2/-9 protein and secreting. Conclusion miR-137 gene transfection can inhibit the invaion of human uveal malignant melanoma cell by reduce the expression of MMP-2 and MMP-9.

uveal melanoma; invasion; miR-137; matrix metalloproteinase

广东省自然科学基金资助项目(2014013301)。

陈俊杰(1979-)，男，本科，主治医师，研究方向为眼部恶性肿瘤浸润及侵袭机制。E-mail:chenjj163163@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.06.006

R773.3

A

1002-266X(2015)06-0018-03

2014-11-20)