正交法试验优选豨莶草的提取工艺

张磊 刘佳 于静

豨莶草为菊科植物豨莶Siegebeckia orientalis L、腺梗豨莶Spubescens Makino或毛梗豨莶Sglabrescens Makino 3种植物的干燥地上部分，具有祛风湿、利关节、解毒的功效，常用于风湿痹痛、筋骨无力、腰膝酸软、四肢麻痹、半身不遂、风疹湿疮等症［1］。化学成分主要含萜和苷类等［2］，其中奇壬醇、豨莶精醇、豨莶苷在免疫调节、抗炎抗风湿、心血管系统、抗病原微生物、抗氧化及抗早孕方面有明显活性［3］。目前，奇壬醇作为其定量检测标准［4］。故本实验拟以奇壬醇为指标，采用HPLC法测定，利用正交试验设计，分别以70%、80%和90%乙醇为溶媒加热回流提取，考察影响奇壬醇提取率的因素，筛选豨莶草的最佳提取工艺条件。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药 美国Agilent-1100高效液相色谱仪系统(在线脱气机，四元泵，自动进样器，PDA检测器);Agilent Chem Office色谱工作站。甲醇、乙腈为色谱纯(国药集团化学试剂有限公司)，水为灭菌注射用水(石家庄四药有限公司，批号130925404)，其他试剂均为分析纯。奇壬醇对照品(批号111726-200601)由中国生物制品检定所提供。豨莶草购于国药乐仁堂石家庄药材公司，经河北省药品检验院段吉平主任药师鉴定为豨莶草的全草。

1.2 方法

1.2.1 供式品溶液的制备:精密称取豨莶草20.0 g置于500 ml圆底烧瓶中，加适量乙醇溶液提取，摇匀，称定质量，加热回流提取40 min，取出，冷却，用适量乙醇溶液补足质量，摇匀，微孔滤膜(0.45 μm)滤过，即得。

1.2.2 对照品溶液的制备:取奇壬醇对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释制成质量浓度分为为0.24 mg/ml的溶液，即得。

1.2.3 色谱条件:色谱柱为 Kromasil WQ C8柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);甲醇-乙腈 － 0.05 mol/L KH2PO4溶液为流动相梯度洗脱，洗脱程序见表1;检测波长215 nm;体积流量1 ml/min;柱温30℃;进样量10 μl。

表1 梯度洗脱程序表

1.2.4 线性关系:取奇壬醇对照品储备液，稀释使配制成奇壬醇为15～240 μg/ml的对照品溶液。吸取上述溶液10 μl，注入HPLC色谱仪，记录峰面积。以质量浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，经回归处理得回归方程为，奇壬醇:Y=6.57X+9.50(R2=0.9999)。结果表明奇壬醇在 0.15 ～2.4 μg呈良好的线性关系。

2 结果

2.1 正交试验设计因素与水平 以奇壬醇的提取量为指标，选用L9(34)正交试验表，对提取次数、提取时间、提取溶媒和溶媒用量进行考察。取豨莶草20 g，按L9(34)正交试验表设计分别进行提取，所得的提取液经合并、滤过，浓缩至一定体积，作为1～9号样品。取1～9号样品，制备供试品溶液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，按上述色谱条件测定色谱峰的峰面积，计算样品中奇壬醇的提取率(奇壬醇提取率=样品中奇壬醇总量/投入药材中豨莶草总量×100%)。见表4。

表2 因素水平

表3 L9(34)试验安排和结果

表4 方差分析表

2.2 提取工艺优选 可知在上述4个因素中，对奇壬醇提取率的影响程度依次为:D＞B＞C＞A。据测定结果并考虑省时节能、降低成本的角度，优选出最佳提取工艺为A2B3C2D3，即80%乙醇回流提取3次，每次40 min，12 倍溶媒。

2.3 验证试验

2.3.1 精密度试验:取豨莶草药材适量，精密称定，制备供试品溶液，吸取10 μl，注入高效液相色谱仪，重复进样6次，按确定的色谱条件记录峰面积，奇壬醇质量分数的RSD 0.6%。

2.3.2 稳定性试验:取豨莶草药材适量，精密称定，制备供试品溶液，分别于 0、2、4、6、8、12、24 h，吸取10 μl，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，奇壬醇质量分数的 RSD为1.0%，说明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.3 重现性试验:取豨莶草药材适量，精密称定6份，制备供试品溶液，分别吸取10 μl，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，奇壬醇质量分数的RSD为1.7%。

2.3.4 回收率试验:取豨莶草药材约10.0 g，共6份，精密称定，精密量取奇壬醇对照品溶液1 ml(约相当于豨莶草药材含奇壬醇的50%)，依次加入上述6份药材中，制备供试品溶液，分别吸取10 μl，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，奇壬醇的平均回收率为99.18%，RSD 为 0.9%。

3 讨论

2005年版《中国药典》收载豨莶草的质量控制指标成分为奇壬醇，因为奇壬醇为3种药用豨莶草原植物的共有成分，专属性强且为主要的活性成分。有文献证实用HPLC法测定豨莶草中奇壬醇的含量简便易行、准确、重复性好［5，6］。但未有文献考察不同提取工艺对奇壬醇提取率的影响。故本实验以奇壬醇为指标，采用HPLC法测定，利用正交试验设计，考察影响奇壬醇提取率的因素，筛选豨莶草的最佳提取工艺条件。

历代本草对豨莶草的毒性考证为“有小毒”，但有文献研究豨莶草水煎醇沉剂毒性较小，其半数致死量LD50测定相当于生药414.3 g/kg，与水煎剂的LD50则相当于生药146.7 g/kg相比，表明水煎醇沉剂的LD50剂量大于水煎剂，即水煎醇沉剂较水煎剂毒性减小［7］。该小组学者继续研究发现毒性成分主要存在于极性大的溶剂中，而其有效成分存在于极性小的溶剂中［8］。故本实验直接采用乙醇为溶媒对豨莶草进行提取，并从溶媒浓度、溶媒用量/倍、提取时间、提取次数四个方面考察。

本实验通过正交试验表设计分别进行提取，并进行方差分析得出结论4个因素对奇壬醇提取率的影响程度依次为提取次数＞提取时间＞溶媒用量＞提取溶媒，综合结果表明豨莶草采用80%乙醇回流提取3次，每次40 min，12倍量溶媒为最佳工艺。经方法学考察试验表明，本方法的线性好，精密度高，重现性及回收率均较好，测得结果准确。

1 张超，吴素香，楼招欢，等.豨莶草化学成分、药理作用及临床应用研究进展.安徽医药，2011，15:274-276.

2 程志红，侴桂新，王铮涛.豨莶草的质量标准研究.中国中药杂志，2005，30:257-259.

3 侴桂新，金若敏，王铮涛，等.豨莶草抗血栓有效组分成分分析.中药材，2006，29:235-237.

4 国家药典委员会主编.中华人民共和国药典.第1部.北京:中国医药科技出版社，2010.345.

5 刘赞，侴桂新，王铮涛.高效液相色谱法测定酒豨莶草中奇壬醇的含量.中国中药杂志，2010，35:729-731.

6 许凤清，刘金旗，王举涛，等.高效液相色谱法同时测定豨莶草中豨莶苷和奇壬醇.中成药，2011，33:1444-1446.

7 关建红，薛征，任晋斌.豨莶草水煎醇沉剂口服小鼠急性毒性.中国中药杂志，2005，30:1712-1713.

8 关建红，裴香萍，刘秉成.豨莶草不同提取部位毒性比较研究.山西中医学院学报，2009，10:15-16.