响应面优化提取桔梗多糖及其抗癌活性研究

陆文总，高 帆，郭 锐，赵 晨，贾光锋

（西安工业大学 电子信息工程学院，西安710021）

近年来，由于化学合成药物的毒副作用使其已 不能获得理想的治疗效果，人们越来越倾向于寻找绿色的天然中草药.因此，发挥我国药用植物资源丰富的优势，从中草药中寻找抗肿瘤新药是开发新药的一条重要途径.桔梗为多年生草本植物，药用其根，其富含桔梗皂甙、多糖、萜类、桔梗酸等成分.近代药理和临床医学研究表明，它具有镇咳、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、提高人体免疫力等广泛的药理活性［1－4］.在中草药溶剂萃取法的发展中，各种参数在优化实验条件中发挥重要的作用.有学者对桔梗多糖的优化提取采用了正交试验［5］，但是响应面法获得的结果更直观，且可以反应各因素间的交互作用［6－7］.目前国内外学者对桔梗的研究主要集中在脂溶性的皂苷类物质，而水溶性多糖物质因其结构复杂且不易纯化，对多糖的提取及生物活性研究较少.提取时间、提取温度、提取的重复数和固体－液体比通常被认为是影响中草药多糖产率的最重要因素，本研究以多糖提取率为响应值，采用中心组合设计的方法，研究各自变量及其交互作用对桔梗多糖提取率的影响，并利用比色法评价其对HeLa癌细胞生长的影响.

1 材料与方法

1.1 试验材料

二氧化碳培养箱、多功能酶标仪（MK-3）、旋转蒸发仪、HeLa细胞株、96－孔板、RPMI－1640 细胞培养基、胎牛血清，［3-（4，5－二甲基噻唑－2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐］（MTT）、胰蛋白酶和二甲基亚砜（DMSO），其它化学试剂均为分析纯.桔梗购于西安市万寿路中药材批发市场，经专家鉴定为正品.

1.2 多糖提取工艺

为了确定料液比对多糖产率的影响，风干的12g，6g，4g，3g，2.4g桔梗样品分别加入120 mL的蒸馏水，获得料液比为1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60g·mL－1预处理样.在室温（28±2）℃高温（90±2）℃下分别提取24h，60 min，搅拌速度为300rpm，收集冷、热水提物.

为了确定提取温度和时间对多糖产率的影响，试验设计5种不同提取温度（50，60，70，80，90）℃，料液比为1∶30，提取时间为0～6h.使用多级交错提取法确定提取次数对多糖产率的影响.在第一阶段，热水加入原料（料液比为1∶30）混合，通过离心获得残留物，每次的残留物经过热水重新提取，直至5次.5 000rpm离心10min后，收集含多糖的上清液，浓缩.浓缩液中加入95%的乙醇析出桔梗多糖，4 000rpm离心5min后，收集多糖.

1.3 提取条件优化

在单因素实验基础上，确定主要影响桔梗多糖产率的三个因素为料液比、提取温度、时间.根据Box－Behnken Design中心组合试验设计原理，结合单因素试验结果，采用3因素3水平的响应面法优化多糖提取参数，试验因素与水平设计见表1～2.

表1 响应面分析因素与水平Tab.1 Variables and levels of response surface design

1.4 总糖含量测定

采用硫酸苯酚法测定桔梗粗多糖提取物的总糖含量［8］.粗多糖提取率（%干重）＝（粗多糖／样品干重）×100%.

1.5 多糖对HeLa细胞生长的影响

采用传统的MTT法检测桔梗多糖对人宫颈癌HeLa细胞生长的影响.将HeLa细胞接种在含10%胎牛血清、100U／ml青霉素、100μg·mL－1链霉素的RPMI－1640培养基的培养皿内，在37℃和5%CO2培养箱培养，当细胞铺满培养瓶的80%～90%时，以0.25%胰酶消化进行传代.调整对数生长期细胞密度至3×105mL，接种于96孔细胞培养板，每孔150μl，在37℃、5%CO2培养箱中培养24h使细胞完全贴壁.加入桔梗多糖处理，使其终浓度为 10，20，40，60，80，100μg·mL－1，培养箱中培养48h.每孔加入10mg·mL－1MTT 10μL，继续培养4h，弃去培养液，加入150μL DMSO，置于酶标仪上492nm处测定光密度值（Optical Density，OD）.

细胞生长抑制率＝（1－处理组平均OD值／对照组平均OD值）×100%

1.6 数据统计

表2 响应面分析方案及试验结果（n＝3）Tab.2 Experimental results and response surface design（n＝3）

2 结 果

2.1 料液比对多糖提取率影响

在不同的料液比条件下，室温下桔梗粗多糖提取率不超过1.5%；在90℃下，粗多糖提取率为2.5%～6.2%如图1所示.料液比为1∶10，90℃，30min时发现有凝胶化现象，因此1∶10的料液比在90℃下不能用于提取多糖.料液比为1∶30时，粗多糖提取率约为6%，随着水体积的增加多糖提取率增高不显著.

图1 料液比对多糖产率的影响Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio on polysaccharide yield

2.2 提取温度和时间对多糖提取率影响

固定料液比为1∶30g·mL－1条件下，研究温度和时间对粗多糖提取率的影响.随着提取温度的升高，粗多糖提取率不断上升如图2所示.实验结果表明，在（50，60，70，80）℃下提取120min粗多糖提取率达到饱和水平，分别为4.2%，4.3%，于4.5%，4.7%；而在90℃下提取90min，粗多糖提取率已达到饱和水平5.8%.且粗多糖提取率要达到5%，80℃下需提取180min，90℃下只需50min.

图2 提取温度和时间对多糖产率的影响Fig.2 Effect of the extraction temperature and time on polysaccharide yield

2.3 提取次数对多糖提取率影响

固定料液比为1∶30g·mL－1、90℃条件下，第一次提取60min，120min，桔梗粗多糖提取率分别为5.3%和5.6%.第二次提取后粗多糖的提取率小于0.5%，而第三次提取时，粗多糖产率接近0.1%如图3所示.

2.4 优化多糖提取条件

应用Design Expert软件对试验数据进行回归分析，结果见表3.

图3 提取次数对多糖产率的影响Fig.3 Effect of the number of the extraction on polysaccharide yield

表3 响应面二次模型方差分析表Tab.3 ANOVA for response surface quadratic model

对各因素回归拟合得到回归方程：提取率＝4.63＋0.24 X1＋0.80 X2＋0.73 X3＋0.14 X1X2＋0.005 X1X3－0.29 X2X3－0.29 X12＋0.41 X22－0.33 X23.该模型统计结果见表3，回归方程中因变量和全体自变量之间的线性关系显著（r＝11.71／12.17＝0.96，P＜0.01），所以该试验方法是科学的.对响应值作用显著的是 X2、X3、X22（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05），对提取率影响大小依次是提取温度、时间和料液比，即提取温度对桔梗粗多糖提取率的影响最显著.

图4 提取因素对多糖产率的响应面及等高线Fig.4 Response surface and contour plot of different extraction factors on the yield of polysaccharide

模型的响应面及其等高线如图4所示，等高线图的形状可以反映出交互效应的强弱，圆形表示两因素的交互作用不显著，椭圆形则相反.试验结果表明，等高线沿着自变量的轴走向密度较小、曲线不陡，表明提取时间、温度和料液比之间的两两交互作用不显著，与统计结果相符.

应用Design Expert软件进行提取工艺优化条件：提取时间81.6min、温度90℃、料液比1∶36.7g·mL－1，多糖提取率为6.1%.为了检验试验结果的真实性，根据以上结果进行近似验证试验，选择提取时间80min、温度90℃、料液比1∶35进行3次重复试验，其结果提取率平均值为6%，实测值与预测值很接近，说明该模型是科学有效的.

2.5 粗多糖中总糖含量

经过硫酸苯酚法测定，桔梗粗多糖提取物的总糖含量为35.2%.

2.6 抗HeLa细胞生长活性

为了初步鉴定桔梗多糖是否具有抗癌活性，利用MTT法来研究桔梗多糖对HeLa细胞的生长抑制作用.试验结果如图5所示，桔梗多糖处理HeLa细胞48h后的抑制率与作用剂量的回归方程为y＝0.7885x＋10.358（R2＝0.9615），半数抑制浓度IC50为50.28μg·mL－1.并且，多糖浓度为80、100μg·mL－1时对HeLa细胞的抑制作用差异不显著，我们推测桔梗多糖体外具有抑制HeLa细胞生长的作用.

图5 MTT法测定多糖HeLa细胞生长的抑制作用Fig.5 The cytotoxic effect of polysacharide on HeLa cells by MTT assay

3 讨 论

3.1 料液比对桔梗多糖提取工艺的影响

在多糖提取过程中，料液比增大，可增加药材与溶剂的接触面积，使多糖分子容易从样料表面扩散出来.而且，提高水的体积能增加多糖从药材颗粒中解析量以及增加水溶剂进入细胞的扩散系数.但是料液比越大，消耗的动力也越大，在动力因素一定的条件下，溶剂过多，多糖溶出率反而更低，因此从经济上和多糖提取率综合考虑，确定最佳料液比为1∶30.

3.2 提取温度和时间对桔梗多糖提取工艺的影响

提高温度能使水溶液粘性较小和传质阻力最小化，因此在高温比低温时多糖的提取率较高.在一些报道中，植物多糖提取温度约为90℃，温度过高会容易影响多糖物质的活性特性，甚至使多糖物质的活性丧失.在90℃下，提取90min桔梗多糖产率已接近饱和水平.而且，提取时间越长，溶出的杂质也会越多.因此为了避免消耗更多的时间和减少后续处理工作量，确定最佳提取温度为90℃，提取90min.

3.3 提取次数对桔梗多糖提取工艺的影响

第二次提取中多糖得率比第一次明显减少，且提取次数越多，消耗的动力能源和时间越多，浓缩成本也越高，因此从实际生产成本考虑，提取1次是水提多糖的最适次数.

3.4 桔梗多糖提取工艺的优化

响应曲面法采用多元二次回归方法，通过研究因素与因素间的交互作用，对拟合后的回归方程进行分析，筛选最佳提取条件，同时能直观地分析各因素的相互影响，试验周期短，精密度高［9］.试验分析得出的最佳提取条件，通过验证试验发现其结果与预测值相近，说明在桔梗多糖提取的实际生产中可以使用此最优工艺.

3.5 粗多糖中总糖含量

多糖是极性大分子化合物，通常破碎后的原料常用水做溶剂来提取粗多糖.因为大部分活性多糖在有机溶剂中的溶解度极低，所以获得粗多糖提取液后，常用乙醇来沉淀粗多糖.经乙醇沉淀获得的粗多糖中，还含有大分子蛋白质、脂类、有机溶剂不溶的一些低分子质量有机物及无机物.粗多糖是复合型杂多糖，主要有黏多糖、脂多糖、结合多糖（糖蛋白及黏蛋白）、可溶性寡糖、单糖等，各种中草药粗多糖的总糖含量也不相同.

3.6 桔梗多糖对HeLa细胞生长的影响

中药多糖具有调节免疫功能、抗辐射和抗肿瘤等多种生物学活性.特别是多糖的抗肿瘤作用具有毒副作用小，能提高机体的免疫功能并抑制肿瘤生长，与化疗药物适当组合，可降低或免除化疗药物带来的免疫抑制以及其他毒副作用等特点，为恶性肿瘤的治疗开辟了新的方向［10］.试验结果表明，桔梗粗多糖对HeLa癌细胞具有较好的抑制其生长的作用，为其后期的研究奠定了基础.粗多糖成分复杂，很可能含有多种活性糖类分子，不同的活性糖类分子对HeLa细胞生长的影响也各不相同.在后期的试验中需要筛选确定出抑制HeLa细胞生长的活性多糖分子，进一步进行其构效关系的研究.

4 结 论

通过响应面法优化了水提醇沉法提取桔梗粗多糖，其最佳提取参数：提取时间81.6min、温度90℃、料液比1∶36.7g·mL－1，多糖提取率为6.1%.桔梗粗多糖显著地抑制HeLa细胞的生长，该研究结果对桔梗多糖在生物、医学领域的深入开发具有一定的参考价值.

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