梅毒螺旋体主要膜蛋白的免疫学研究进展

朱 芸，连 石，张海萍，朱 威

梅毒是一种慢性、全身性性传播疾病，其临床表现复杂多样，可累及全身多个器官系统，严重危害人类健康[1]。我国的梅毒发病率仍然在各类性传播疾病中居于首位。据《中国预防与控制梅毒规划（2010—2020）》（中华人民共和国卫生部）统计，2009年全国新发病例达10 757例， 上一年增长49.2%，且继续呈上升趋势[2]。由于其病原体——梅毒螺旋体（Treponema pallidum，TP）的体外培养困难，至今尚未获得成功，故限制了相关的基础与临床研究。随着分子生物学技术的进步，近年来关于TP的研究不断涌现出新的热点，本文就相关的免疫学内容综述如下。

1 TP的主要膜脂蛋白

以往研究认为，TP的部分膜脂蛋白具有免疫原性，在激活炎症细胞、诱发机体免疫反应等方面具有重大作用。Fraser等于1998年完成了TP DNA的全基因组测序，他们测定出TP全长为1 138 006 bp，含有1 041个开放阅读框架（opening reading frames，ORF），并推测TP可能具有22种外膜脂蛋白[3]。McKevitt等认为这些脂蛋白中至少有12种与TP的致病性密切相关，完整膜脂蛋白的缺乏可能是造成TP免疫逃避的机制之一[4]。

在TP的众多膜脂蛋白中，目前研究较多的有TpN47(Tp0574)、TpN17(Tp0435)、TpN15(Tp0171)以及TmpA(Tp0768)，这些脂蛋白具有强大的前炎症活性，与TP引起的梅毒免疫反应密切相关[5,6]，其组合抗原已广泛应用于检测TP的试剂盒中[7]。此外，近年来研究较多的蛋白还有Tp0453、Tp92(Tp0326)、Gpd(TP0257)，以及Tp0655、Tp0993等。

Wesley等于2003年应用计算机软件筛选的办法推测出若干种可能的TP膜脂蛋白，并采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测重组蛋白的敏感性和特异性。结果发现 Tp0453、Tp92(Tp0326)、Gpd(TP0257)均为可能的TP膜脂蛋白，其中Tp0453的敏感性和特异性最高（100%），后两者的敏感性、特异性分别为98%、97%以及91%、93%，并认为此3种蛋白能够单独或混合用于梅毒的血清学诊断[8]。Tp0453长864 bp，编码287个氨基酸，分子量约为31 900。Hazlett等[9]认为Tp0453是一种特殊的膜蛋白，其结构域中富含α-螺旋而缺乏β-折叠，前者嵌入TP膜脂质双分子层中，但不暴露于TP表面，无法被免疫系统识别，这是TP逃避宿主免疫反应的可能机制之一。此外，Hazlett等[9]证实Tp0453能够促进某种marker的经膜释放，这提示其可能与TP营养物质的代谢密切相关。Liu等[10]利用基因工程技术成功制备出Tp0453重组蛋白，并用其免疫新西兰家兔，证明具有良好的免疫原性；蛋白印迹法(Western-blot)和ELISA方法使其与患者血清反应，证明具有良好的免疫反应性。

Tp0655全长1 047 bp，编码348个氨基酸。细菌中的膜脂蛋白往往具有参与信号转导、物质转运，参与酶促反应，激活机体免疫应答等多方面的作用。Machius等[11]应用基因工程技术制备rTp0655，X线衍射技术测定其晶体结构，并验证功能。结果证实Tp0655为TP的膜脂蛋白，其结构与E.coli的PotD具有同源性，是ATP-结合盒(ATP-binding cassette,ABC)的重要转运蛋白，能够优先与腐胺特异性结合，其次与亚精胺结合，后两者在维持细胞的生长、分化和死亡过程中具有重要作用。此外，由于TP缺乏鸟氨酸、精氨酸脱羧酶[2,12]，故Tp0655可能在细胞代谢过程中承担着较为重要的作用。多胺在体液中浓度较低，而在宿主细胞内浓度较高，Machius等[11]据此推测TP可能在发病过程中的某一阶段侵入人体细胞中获取代谢原料，这与传统上TP不侵入细胞内的观念有所差异，具体情况有待进一步研究证实。

Tp0993全长957 bp，编码318个氨基酸，分子量约为33 300。McKevitt等[13]于2005年利用基因工程技术重组表达了882种TP蛋白，并将其与TP感染后的新西兰兔血清反应，发现其中106种蛋白具有较强的免疫反应性，包括22种已知蛋白和84种未知蛋白。Tp0993在此次实验中首次被发现，并能够与TP感染新西兰兔后各个时期（第14天，28天，56天和84天）的血清产生免疫反应。McKevitt等认为Tp0993是一种含量较低的TP脂蛋白，推测其可能位于TP外膜上，这可能与其较好的免疫性相关。Brinkman等[14]于2006年用类似方法获得908种TP重组蛋白，以梅毒患者血清代替新西兰兔血清进行实验，发现Tp0993能与各期患者血清发生良好的免疫反应（潜伏梅毒，早期、晚期梅毒），并且与正常对照组血清不反应，这提示Tp0993可以作为潜在抗原，对各期梅毒具有诊断价值。我国谢小平等[15]以Tp0993重组蛋白为抗原建立ELISA检测系统，对480例临床血清进行分析，证实其灵敏度及特异性均较高，可作为梅毒诊断的候选抗原之一。

2 TPrK蛋白

TprK是一种特殊的TP膜蛋白，属于TprP重复蛋白家族的12种蛋白(TprA~L)之一，后者又可分为Ⅰ(TprC、D、F、I)、Ⅱ(TprE、G、J)、Ⅲ(TprA、B、H、K、L)3个亚家族。近年来研究认为TprK蛋白既能诱导机体产生保护性免疫反应，又是梅毒螺旋体发生免疫逃避的重要原因之一，故单独综述如下。

Centurion等[16]较早对TprK蛋白进行了报道，他们通过对TprK基因的ORF进行DNA测序，推测其包括若干个含有高度保守序列的恒定区及7个可变区（V区），可变区序列与TprP的Ⅰ、Ⅱ两个亚家族缺乏同源性，可能具有较强的免疫特异性。LaFond等[17]对TprK蛋白V区的可变性进行了研究，他们用3种不同的TP菌株感染新西兰兔，发现经Chicago A株感染后获得的血清对可变区V5、6、7产生免疫应答反应，经Chicago B株感染后对V2、V4～7产生应答，而经Chicago C株感染后则对V2～7产生应答，且各型菌株与血清之间几乎不存在交叉反应。TprK基因的高度可变性可能在TP逃避宿主免疫反应中发挥作用，这是导致梅毒感染慢性化的可能机制之一。

TprK蛋白能诱导机体同时产生体液免疫和细胞免疫[16]。Morgan等[18]用TprK蛋白片段免疫新西兰兔，并使其再次接触同菌株TP后，发现家兔体内的脾细胞出现增生反应，且兔血清能够对TprK蛋白产生免疫应答反应。其中，TprK的恒定区具有T淋巴细胞识别表位，而V区则具有B淋巴细胞识别表位。同时，家兔体表溃疡出现更晚，且溃疡的面积和数量均小于正常对照组，这提示TprK诱导家兔产生的免疫反应具有保护性。Giacani等[19]对4种不同TP菌株免疫新西兰兔后Tpr基因的mRNA转录水平进行了实时PCR定量测定，并测定了不同感染时期T淋巴细胞的反应情况。结果发现TprK基因的表达在4种菌株中均高于其他基因，但低于作为参照的47-KDa脂蛋白基因。各菌株免疫的家兔表现出不同强度的T淋巴细胞反应性，亚家族Ⅰ中的TprC、D能诱导家兔脾细胞增生，而TprK诱导的这一反应更为强烈。此外，T淋巴细胞对于TprK蛋白的反应性在各个时期的家兔中均维持在较高水平，这提示TprK基因可能在长期感染过程中一直处于转录状态。

抗原变异是病原体逃避宿主免疫、引起感染慢性化的常见机制。免疫压力(immune pressure)属于生物进化过程中选择压力(selective pressure）的一种，是病原体变异的主要动力之一。最近，Giacani等[20]对免疫压力作用下TP的抗原变异状况及其原因进行了研究。他们将TP感染后的新西兰兔分为免疫活性组和免疫抑制组（注射甲泼尼龙），6周后进行抗体检测、基因测序及mRNA测序。结果发现免疫抑制组家兔的抗体产生时间晚、数量少，局部皮损的数目更多、面积更大。抑制组与对照组家兔的TprK基因V4~V7区分别于感染后第5、5、3、4周出现统计学差异，后者表现出更强的变异性。值得注意的是，随着感染时间的延长，V6区基因多样性的增加与抗-V6抗体数目的增长呈现出平行关系，这提示特异性抗-V6抗体在TprK的基因选择及其导致的TP抗原变异种中可能起到一定作用。

3 应用

梅毒的实验室检测是诊断梅毒的重要手段之一，目前国内外均已有多种商业化的成品试剂盒，但仍不能用于各期梅毒的检测[7,21]。对于TP的免疫学研究，有助于为各期梅毒提供全面、有效的诊断方法，并使梅毒疫苗的研制成为可能。

目前常用的梅毒检测方法是将TP重组膜蛋白Tp47、Tp15、Tp17、TmpA、Tp37中的2种以上作为混合抗原，应用ELISA、Western-blot、免疫层析法(ICA)等方法，通过检测血清中的TP特异性抗体，达到诊断梅毒的目的[22]。这些检测方法存在生物学假阳性、假阴性的可能，且对于TP感染早期、免疫功能低下患者以及晚期梅毒患者诊断效果不佳。随着计算机及分子生物学技术的发展，学者们一方面利用生物信息学软件分析、寻找其他具有潜在诊断价值的TP蛋白，另一方面通过基因重组技术获得大量蛋白，随后再验证其免疫原性及免疫反应性。目前的研究热点除上文提到的Tp0453、Tp92、Gpd、Tp0993等外，还有Tp0136、Tp0751、Tp0319[23-25]等重组蛋白。这些蛋白能够与Tp47等蛋白联合应用，作为混合抗原应用于梅毒的诊断。虽然目前关于这些蛋白的研究大多停留在实验室阶段，但其未来的应用前景仍然值得期待。

梅毒与HIV共感染的现象近年来越来越受到人们的关注。梅毒引起的生殖器溃疡促进了HIV的传播，其造成的短暂免疫功能异常又有可能引起HIV病毒载量的增加和CD4细胞数的下降[26,27]，因此，梅毒疫苗的研究具有切实的临床意义和价值。由于TP无法在体外进行培养，且细胞结构不稳定、不便于操作，故其重组亚单位疫苗的研制是目前主要的研究方向。梅毒发病的免疫学机制复杂，动物实验仅证实Tp19、Tp36、Gpd等具有部分保护作用[28]，国内外尚未研制出具有完全保护作用的疫苗[29]。上文中提到的TprK蛋白具有较强的免疫原性和免疫反应性，且能够在TP感染后持续存在，可作为TP疫苗的候选抗原，但具体应用价值有待于进一步研究。

4 小结

梅毒是性病中危害较大的疾病，目前关于其致病机制、免疫应答等问题尚未完全明确，其诊断、治疗及疫苗等课题有待进一步研究。随着基因工程、蛋白质组学等技术的发展，TP的免疫学研究必将进一步深入和细化，从而带动梅毒领域的全方位研究，达到促进人类健康的最终目的。

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