动物模型在经方研究中的应用

高誉珊 刘 妙 张淑静 郑丰杰 许 红 王 谦 吴 莹 李宇航

(北京中医药大学，北京，100029)

中医动物模型的建立与研究是连接中医基础研究和临床应用的桥梁与纽带，是深化中医基础认识的方法，同时也是中药药物作用机制深入研究的手段。动物模型是运用病因病机理论和脏象学说，把人类疾病的某些特征在动物身上加以模拟复制而成，是中医学人体证候的具体再现。经过50多年的努力，中医证候的动物模型研究通过不断的发展和完善日渐成熟，已从简单的证候模拟发展到更加注重体现中医病因病机实质的造模手段。研究思路和造模手段有3类:一类是采用物理、化学、自然衰老、基因改变等方法，模拟中医认识的致病因素，如外伤、寒凝、肝郁、气虚等，制成的相应动物模型，此类属病因模型;二类是多采用手术方法，模拟西医病理机制，如血管阻塞、内皮损伤、微循环障碍和肠梗阻等，制成的相应动物模型，此类属病理或病理生理模型;三类是采用物理、化学、手术等方法，模拟中医临床表现，此类属症状类模型。

我团队将动物模型应用到中医基础研究中，且获得了一些经验。本实验室用于经方现代研究的动物模型10余种，例如:大鼠COPD模型、小鼠哮喘模型、便秘模型、胃炎模型、胃电节律失常模型、脑出血模型、寒热证模型、帕金森氏病模型、癫痫模型等。现例举五种，从造模方法、体会及经方研究等方面介绍如下。

1 慢性阻塞性肺疾病模型

1.1 造模方法 慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)是一种具有气流受限特征的疾病，气流受限不完全可逆，呈进行性发展，与肺部对香烟烟雾等有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关。其病理学改变存在于中央气道、外周气道、肺实质和肺的血管系统。肺组织、气管、支气管上皮炎症细胞浸润，典型的肺实质破坏表现为小叶中央型肺气肿，涉及呼吸性细支气管的扩张和破坏［1］。

目前常用的COPD动物模型制作方法有采用熏香烟加气管注内毒素和单纯熏烟法复制大鼠COPD模型［2］。单纯熏香烟法是每天单纯熏5%香烟0.5 h/d，共3个月;熏香烟加气管注内毒素法是在熏烟的基础上分别于第1天、第14天经气管注入内毒素。两种方法的病理结果与临床COPD患者病理结果相符，但症状稍轻。我们在过往的研究中，多数采用了熏烟加气管注内毒素的方法，来进行脏腑表里相关理论的研究。

1.2 体会 这种方法看似简单，但实际操作中有很多需要注意的方面。

1)环境影响:实验需要选择在SPF环境下进行，一是排除天气变化等干扰原因，例如:春秋季节呼吸系统疾病高发，在注射完内毒素及熏烟后，动物精神及健康状态较差，容易突发其他疾病，使研究结果受到影响;二是模型组动物熏烟后皮毛会附着烟雾颗粒，在换气不良的环境下长时间共同饲养时会对未造模组产生影响，从而干扰试验结果。

2)熏烟方法:熏烟过程中，要通过计算熏烟箱内的体积得出达到要求浓度所需的香烟数量，在注入香烟气体后，实验箱内氧气含量有限，应严格控制箱内动物数量并且密切观察，防止出现动物缺氧死亡的情况。

3)气管内注射内毒素的方法有两种:一种是经口腔向气管内插入套管针，再注入内毒素。这种方法操作简便，成功率高，对动物不会产生实质性损害，但对操作人员技术要求较高且无法控制药液进入气管以后的分布情况。另一种方法是切开皮肤，暴露气管及支气管，用注射器将等量内毒素分别注射入左肺和右肺。这种方法操作简单，剂量控制准确，但伤口较大，护理不当易发生感染影响实验结果。两种方法各有千秋，但均可以达到利用内毒素对器官进行影响的目的。

4)麻醉药物的选择:在注射内毒素时需要将动物麻醉，此时不应选用能促进动物唾液分泌的药物。

5)造模护理:注射内毒素时动物处于麻醉状态，注射后等待其苏醒的时间是最重要的环节，也是死亡高发的环节，护理人员一定要细心观察并及时清理分泌的唾液和从气管返出的药物，保持呼吸道通畅，若是气温较低的季节还应注意动物的保暖，直至动物苏醒。

1.3 经方研究举例 本团队曾采用大鼠COPD模型应用于经方大承气汤衍化方宣白承气汤的研究。通过用宣白承气汤及加减方对COPD模型大鼠进行治疗发现，宣白承气汤可降低COPD大鼠模型的外周血和肺泡灌洗液中以上细胞因子含量，减轻全身及局部的炎症反应［3］，改善COPD模型大鼠肺功能及血气［4］，此外，基于此动物模型，我们还发现宣白承气汤亦可降低MUC5ACmRNA水平及蛋白表达，增强AQP5 mRNA、AQP1、AQP3水平及蛋白表达，从而抑制气道黏液高分泌［5-6］。

将COPD模型大鼠用于经方桔梗汤及其加味的研究。加味桔梗汤对COPD模型大鼠进行干预后发现，加味桔梗汤从肺治肠治疗“肺病及肠”的效应机制可能与调节肺肠组织中NKA、VIP的含量有关［7］;同时发现，清热解毒药物配伍桔梗，在COPD的治疗过程中能够发挥增效(引经)作用，增加甘草具有协同增效(引经)作用［8］，此外，基于此动物模型，我们还发现桔梗引经入肺的作用机制可能与其增加病理状态下肺组织中VIP含量、改变TFF3mRNA基因表达有关［9-10］。

COPD在中医学中归属于咳嗽、上气、喘证和肺胀的范畴。因此，基于本动物模型，还可用于多种可治疗咳嗽、上气、喘证和肺胀的经方的实验研究，如小青龙汤、越婢加半夏汤、承气汤等等。

2 卵清蛋白致敏支气管哮喘小鼠模型

2.1 造模方法 支气管哮喘，是一种以气道高反应性可变的气流阻塞为特征的气道炎症性疾病，其发病机制与气道慢性炎症变态反应气道高反应以及气道重构等相关。

目前常用的造模方法是采用OVA致敏激发法制备小鼠哮喘模型:即在第1天和第13天，腹腔注射OVA氢氧化铝凝胶混悬液致敏，第15～21天，置于雾化箱中雾化吸入OVA激发。

2.2 体会 操作过程中同样需要注意几点:

1)环境影响:同COPD模型一样，处理过的小鼠身上会沾染致敏烟雾，对不需要进行造模处理的组别会产生较大影响，需要进行一定距离的隔离处理并进行充足的换气排风。

2)需要时刻观察动物情况，防止缺氧致动物批量死亡的情况发生。

3)腹腔注射致敏药物时务必选用氢氧化铝凝胶制剂进行配置，氢氧化铝粉末制剂不能达到良好的致敏效果。

4)不同组动物同时进行处理时要进行有效、全面的分隔，在激发过程中，动物情绪焦躁，会产生窜跑、跳跃的行为，若不进行全面的隔离会混淆组别。

2.3 经方研究举例 本团队曾采用哮喘模型小鼠用于经方大承气汤的研究。通过用大承气汤对支气管哮喘小鼠进行干预，发现大承气汤通过通腑降气，调畅肺肠脏腑气机，改善肺气的宣发肃降，可在一定程度上改善小鼠模型肺部的症状及病理变化［11］，明显减轻哮喘模型小鼠肺部炎症，这一效应的发生可能与肺、肠神经肽NKA、TFF3及VIP的变化密切相关［12］。

哮喘，在中医学中归属于哮证、喘证范畴。目前，对于哮喘的研究一直是呼吸系统疾病研究中的一个热点，而中医药在治疗哮喘方面也起到了重要作用。基于上述哮喘小鼠模型，还可用于多种可治疗哮喘的经方的实验研究，如射干麻黄汤、小青龙汤、桂枝加厚朴杏子汤、麻杏石甘汤等等。

3 大鼠直肠半结扎模型

3.1 造模方法 在脏腑表里相关理论的研究中，我们还常用大鼠直肠半结扎模型对动物进行一定干预，来研究对肺部的影响。大鼠直肠半结扎模型是指通过外部手段，造成大鼠直肠半狭窄，造成肠道不通的疾病动物模型。

常用操作方法为:无菌操作下打开腹腔暴露直肠，以10号线经腹壁在距肛门约1.5cm处从直肠下方绕过，将丝线两端经腹壁引出至腹壁切口两侧，在引出的丝线内套入直径为0.3cm的无菌钢管后打结，退出钢管，使直肠适度狭窄并悬吊于腹壁，关闭腹腔。

3.2 体会 大鼠直肠半结扎模型在造模过程中同时需要注意几点:

1)麻药的选择:麻药不能选择对腹膜有刺激的药物，例如水合氯醛。水合氯醛会对动物腹膜造成刺激，导致在实验后期动物肠胀气，肚大如鼓，有些伤口愈合不好的动物甚至会涨破。

2)无菌操作下暴露直肠难度较大，因为直肠位于腹后壁，暴露直肠势必造成污染，因此，可以在不改变腹部脏器原有位置的情况下，靠手感将干净的手指深入腹腔内将线从直肠后穿出，并轻轻将直肠稍稍拉出，最大限度减少手术对动物其他器官的影响。

3)术后护理:术后护理是所有动物手术造模后非常重要的一项，为了减少感染，在关闭腹腔时可滴入适当的抗生素;缝合时也要尽量针距适当，缝合平整，促进愈合;勤换干净的垫料，给予充足的食物和水分防止相互撕咬。

4)拆线时，采用外科拆线法，用碘酒将暴露在外的缝合线消毒，将缝合线稍稍拉出腹腔后剪断，从另一端拉出。

3.3 经方研究举例 本团队曾将直肠半结扎大鼠模型用于经方大承气汤的研究。通过用大承气汤对直肠半结扎模型大鼠进行干预，发现经大承气汤干预后，大肠及肺脏病理改变减轻，肺泡灌洗液中淋巴细胞数量减少［13］，基于此动物模型，我们还发现，大承气汤干预可明显减轻直肠半结扎模型大鼠的肺部炎症，这一效应的产生与肺组织中VIP、TFF3、NKA含量的变化密切相关［14］。

直肠半结扎动物模型的临床症状变化类似于中医便秘一证，主要引起肠道不通的疾病。基于此模型引起的症状改变，还可以将其用于承气汤类方、麻子仁丸、蜜煎导、土瓜根、大猪胆汁等方的研究。

4 胃溃疡大鼠模型

4.1 造模方法 胃溃疡是一种临床常见的具有反复发作倾向的消化系统疾病，临床多以上腹部疼痛或不适，腹胀、反酸、恶心、呕吐等为特征。相关研究众多，因此制造改模型的手法也非常多，有应激性胃溃疡模型、乙醇致大鼠胃溃疡模型、幽门结扎型胃溃疡模型、药物诱发型胃溃疡模型、和冰醋酸致慢性胃溃疡模型，其中以冰醋酸致慢性胃溃疡模型以其操作方法的简便，易于复制，溃疡面明显且病理结构与人胃溃疡极为相似而被广泛使用。

本团队使用经过改良的Okabe法进行实验造模。具体方法为:将动物禁食48 h，麻醉后，固定于手术台上，剃毛，消毒，铺巾，于剑突下腹中线稍左分层切开腹壁，将胃引出，用内径3 mm的玻璃管按在幽门无血管处，将蘸有纯乙酸0.1 mL的细棉扦插入管内与胃黏膜接触，留滞1.5 min后撤掉，擦净残留酸液，以大网膜包裹，送入腹腔，关腹。术后第3天，禁食12 h，用食管喂以5%NaHCO32 mL，15 min后用胃管注入幽门螺旋菌菌液1.5 mL(103cfu/mL)，30 min后喂食，3 d1 次，共3 次［15］。

4.2 体会 大鼠胃溃疡模型在造模时需要注意以下几点:

1)务必重视无菌操作，因为将胃部引出的过程中极易受到污染，使复原后的腹腔内形成大面积的粘连，影响溃疡面的观察及取材。

2)可在实验前根据不同实验室的情况及不同操作者的手法进行预实验，找出适合本实验组的实验方法，若药量过大或接触时间过长会导致胃穿孔，若接触不够或药量不够则不能成功的造出溃疡面。

3)选好手术通道，尽量选择离操作区域较近的位置打开手术通道，使腹腔内容物位移尽量减小，一是复位简单，减少手术造成的损伤，二是减少手术过程中的污染。

4)选择手术通道时尽量避开血管，务必最大量减少出血，对防止腹腔内粘连有很大的作用，即使出血也在关腹前将血迹擦拭干净。

5)除此种方法之外，也有操作者将乙酸打入浆膜下近肌层，禁食48 h后胃部基本排空，胃壁本十分薄，将药物准确打入指定位置操作难度比较大。

4.3 经方研究举例 本团队曾将胃溃疡大鼠模型应用于经方半夏泻心汤的研究。通过半夏泻心汤对胃溃疡大鼠进行干预，发现半夏泻心汤具有促进溃疡愈合、降低愈合后溃疡复发的治疗作用。基于此动物模型，我们进一步对半夏泻心汤进行拆方分析，发现本方甘补组药物在促进溃疡愈合、降低愈合后溃疡复发方面起主要作用，而全方组则疗效最佳［16］。本实验的研究结果对指导临床治疗消化性溃疡中医用药以及新药开发等，都具有一定的参考价值。

胃溃疡在中医学中归属于“胃脘痛”“嘈杂”“泛酸”等病的范畴。因此，基于本动物模型，还可用于多种可治疗“胃脘痛”“嘈杂”“泛酸”等症的相关经方的实验研究，如泻心汤类方、小建中汤、理中汤、旋覆代赭汤、小陷胸汤等。

5 大鼠胃电节律失常模型

5.1 造模方法 胃电节律失常十分常见，它与胃功能性疾病密切相关，是发生胃运动功能障碍的一个重要原因。在实验研究方面，多为动物体内注入各种激素制剂或药物(如甲啡肽、亮啡肽、PGE2、肾上腺素)诱发胃电节律失常［17］，这种造模方法与临床常见病因有差异，张氏［18］不规则饲喂大鼠胃电节律失常模型从病因角度讲与临床更为接近。

模型组以不规则喂养方法饲养4周，即动物逢单日正常进食、双日禁食，以打乱正常的饮食节律，自由饮水，水中加人盐酸(每升水加10 mol/L盐酸10 mL)以破坏胃内酸碱环境，制备大鼠胃电节律失常模型，2周后胃窦部浆膜下埋置银丝电极，7 d后记录胃电慢波。

5.2 体会 大鼠胃电节律失常模型在造模时需要注意以下几点:

1)在大鼠清醒状态下检测胃电波时，应尽量多人看管或将大鼠头部固定，也可制作一些小配件防止大鼠回头啃咬电极。

2)埋入电极手术时尽量避免使用对腹膜具有刺激的麻药。

3)埋入电极时需要注意的是，一避免出血，二在关闭腹腔时尽量将出血擦干净，能有效避免腹腔内器官粘连。

4)关闭腹腔前可加入适当抗生素防止感染。

5)埋入电极时注意无菌操作，防止胃部出现不必要的感染继而引发糜烂。

5.3 经方研究举例 本团队曾将胃电节律失常大鼠模型应用于经方半夏泻心汤的研究。通过观察半夏泻心汤及其拆方对胃电节律失常大鼠进行干预，发现半夏泻心汤具有纠正胃电节律失常［19］、调节胃肌间神经丛c-kit阳性ICC含量的作用［20］，同时发现，半夏泻心汤治疗心下痞证(调节胃肠运动)的作用机制可能与其调节 SCF、c-kit基因表达有关［21-22］。

胃电节律失常与胃功能型疾病密切相关，是胃运动功能障碍的一个重要原因。虽然胃电节律失常大鼠模型不属于中医“证”的模型，但其临床特征与心下痞的临床表现相似，都以胃脘部满闷不舒、恶心和(或)呕吐、上腹饱胀感、食欲减退为特点。故此模型还可用于消化不良相关疾病的经方研究，如小陷胸汤、枳术丸、茯苓甘草汤、桂枝加芍药汤、旋覆代赭汤、吴茱萸汤等等。

综上所述，除了以上几种常用的造模方法，我们还涉及很多动物模型的研究，被用于经方及其他中医中药的研究中，中医动物模型的研究是一个长期的系统工程，需要随着时代疾病谱的变化而不断完善，将能够反映人类疾病的动物模型，应用到经方研究中，揭示经方治疗常见病、疑难病的现代生物学机制，为人类健康做出贡献。

［1］中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组.慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2007年修订版)［J］.中华内科杂志，2007，46(3):254-2611.

［2］李红梅，崔德健，佟欣，等.熏香烟加气管注内毒素和单纯熏香烟法建立大鼠COPD模型［J］.中国病理生理杂志，2002，18(7):808-812.

［3］王坦，张前，李宇航，等.“通利大肠”对COPD大鼠细胞因子含量的影响［J］.北京中医药大学学报，2013，36(2):104-107.

［4］李宇航，钟相根，贾旭，等.“通利大肠”对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠肺功能及血气的影响［J］.北京中医药大学学报，2010，33(7):452-455.

［5］钟相根，李宇航，贾旭，等.“通利大肠”对慢性阻塞性肺疾病大鼠气道黏液高分泌的影响［J］.北京中医药大学学报，2010，33(12):006.

［6］祝小惠，钟相根，李宇航，等.COPD大鼠AQPsmRNA表达及“从肠论治”干预作用［J］.中华中医药学刊，2011，29(1):39-41.

［7］王毅.慢性阻塞性肺疾病模型大鼠“肺病及肠”的实验观察［D］.北京:北京中医药大学，2011.

［8］李宇航，黄颖，郭明章，等.清热解毒药物配伍桔梗对COPD大鼠模型病理形态的影响［J］.北京中医药大学学报，2008，31(12):819-822，865.

［9］郭明章，黄颖，李宇航，等.桔梗对慢性阻塞性肺疾病大鼠不同组织血管活性肠肽(VIP)含量的影响［J］.中华中医药学刊，2009，27(4):714-715.

［10］黄颖，郭明章，李丽娜，等.桔梗对COPD大鼠不同组织肠三叶因子(TFF3)mRNA基因表达的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2009，15(1):69-71.

［11］徐云.大承气汤对支气管哮喘小鼠肺肠组织相关神经肽的影响［D］.北京:北京中医药大学，2011.

［12］郑丰杰，李宇航，许红，等.通腑对哮喘模型小鼠肺及肠组织VIP、TFF3及 NKA 含量的影响［J］.中华中医药杂志，2012，27(8):2023-2027.

［13］许红，王谦，李宇航，等.直肠半结扎模型大鼠的病理改变［J］.北京中医药大学学报，2010，33(9):610-613，649-650.

［14］郑丰杰，李宇航，许红，等.“通腑”方法对直肠半结扎模型大鼠肺组织NKA，VIP，TFF3含量的影响［J］.北京中医药大学学报，2012，35(1):15-18.

［15］李宇航，王庆国，牛欣，等.半夏泻心汤及其拆方对慢性胃溃疡大鼠胃粘膜细胞增殖活性的影响［J］.北京中医药大学学报，2001，24(3):30-32.

［16］李宇航，李澎涛，王庆国，等.半夏泻心汤及其拆方对慢性胃溃疡大鼠溃疡灶形态变化的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2003，9(1):16-20.

［17］杨君佑，许冠荪.胃电节律紊乱及其机制［J］.国外医学生理病理与临床分册，1990，10(2):70-73.

［18］张勇，王振华.大鼠胃电节律失常模型的建立［J］.世界华人消化杂志，1998，6(7):612-613.

［19］李宇航，王庆国，陈萌，等.半夏泻心汤及其拆方对胃电节律失常大鼠胃电慢波频率变异系数的影响［J］.中国中西医结合杂志，2006，26(S1):53-55.

［20］李宇航，王庆国，杨美娟，等.半夏泻心汤及其拆方对胃电节律失常大鼠胃肌间ICC含量的影响［J］.北京中医药大学学报，2004，27(1):21-23.

［21］李宇航，王庆国，陈萌，等.半夏泻心汤对胃电节律失常大鼠胃壁SCF基因表达水平的影响［J］.中医药学刊，2003，21(11):1825-1826.

［22］王庆国，李宇航，李丽娜，等.半夏泻心汤对胃电节律失常大鼠胃壁 c-kit基因表达水平的影响［J］.中国医药学报，2004，19(3):143-145，132.