β-榄香烯对肺腺癌A549和H460细胞增殖和凋亡的影响*

西安交通大学医学院附属西安市中心医院(西安 710003)

杜旭升　鱼　军　李建英　刘　安　杨拴盈△ 　王一理▲



·论著·基础研究·

β-榄香烯对肺腺癌A549和H460细胞增殖和凋亡的影响*

西安交通大学医学院附属西安市中心医院(西安 710003)

杜旭升鱼军李建英刘安杨拴盈△王一理▲

目的：探讨β-榄香烯对肺腺癌A549和H460细胞增殖和凋亡的影响。方法：应用不同浓度的β-榄香烯干预A549和H460细胞后，台盼蓝拒染试验和MTT试验检测肿瘤细胞的增殖，流式细胞术检测A549细胞凋亡率，Western Blot法检测凋亡相关蛋白的表达。结果：不同浓度β-榄香烯能抑制肺腺癌A549和H460细胞的增殖，且呈剂量与时间依赖性，β-榄香烯干预后的A549细胞凋亡率明显升高，其相关抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl表达下调。结论：β-榄香烯可抑制肺腺癌A549和H460细胞的增殖及诱导其凋亡，其作用机制可能与下调Bcl-2和Bcl-xl有关。

近年来随着手术方式的改进、化疗药物的研发及放疗技术的发展，肺癌患者生存期限有所延长，但仍不能令人们满意[1]。因此，寻找低毒高效的抗肿瘤药物显得尤为迫切。本实验拟通过不同浓度β-榄香烯作用于肺腺癌A549和H460细胞，观察肿瘤细胞的增殖及凋亡率，并探讨其可能机制。

材料与方法

1材料与试剂人肺腺癌细胞A549和H460购自ATCC；试剂：10%胎牛血清、RPMI 1640培养基、脂质体2000购自GIBCO公司；RIPA裂解液购自碧云天生物技术公司；台盼蓝、MTT购自Sigma 公司，BALB/c雄性裸鼠购自西安交通大学实验动物中心，榄香烯注射液购自大连华立金港药业有限公司。

2研究方法

2.1 细胞培养：人肺腺癌细胞A549和H460在含有10%胎牛血清、100 IU/ml青霉素以及100 g/ml链霉素的RPMI 1640培养基中培养。细胞在37℃、含有5% CO2和 95% 空气的培养箱中孵育。

2.2 台盼蓝拒染试验检测细胞活力：具体步骤参见文献[2]。将细胞按3×105每孔的密度铺于96孔板中，使用RPMI 1640培养基培养24h后进行干预，分为空白对照组及β-榄香烯干预组，空白对照组使用DMSO，β-榄香烯干预组使用不同浓度(0, 100, 200, 300, 400, 500and 600 μM)干预剂进行干预。干预结束后，细胞在培养箱中分别孵育24、48及72h。胰酶消化细胞后，经过PBS悬浮，加入40μl台盼蓝混匀，最后使用细胞计数器进行计数，每个浓度具有三个复孔。本实验至少重复3次。

2.3使用3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基溴代四唑试验(MTT)检测细胞增殖，具体步骤参见文献[3]。将细胞按3×105/ml的密度铺于96孔板中，于培养箱中分别孵育24、48及72h，最后每孔中加入20μl的MTT(5 mg/ml)，继续在37℃环境下孵育4h。孵育结束后，弃去上层液体，加入200μl的DMSO，室温中放置20min。使用波长为570nm的分光光度计检测每孔的OD值。每个试验至少重复3次。

2.4流式细胞术检测A549细胞凋亡率：V-FITC和PI染色后用流式细胞仪，将细胞铺于96孔板中后用β-榄香烯进行干预。最终有3×105个细胞用V-FITC/PI染色，被染色的凋亡细胞用流式细胞仪检测。

2.5 Western Blot法检测凋亡蛋白：用RIPA裂解液在A549细胞中提取总蛋白，将等量的蛋白质加入到12%的SDS-PAGE，之后用电泳的方法对蛋白进行分离。一抗为兔单克隆和多克隆抗体，HRP连接的羊抗兔抗体作为二抗。通过ELC显色法将结合的抗体进行显色。β-actin作为内参用于计算其他蛋白质的表达水平。所有实验重复至少3次。

3统计学处理采用SPSS13.0软件进行统计学分析，实验数据以均数±标准差表示。组间比较采用Dunnett法进行检验，以P<0.05为有显著性差异，P<0.01为有极显著性差异。

结　果

1β-榄香烯抑制肺癌细胞的增殖和生存在24、48及72h时间点分别用不同浓度的β-榄香烯对细胞施行干预，结果发现β-榄香烯对A549和H460细胞活力的影响呈现剂量与时间依赖性。β-榄香烯能够显著减少存活细胞的数量，但对A549和H460细胞活力影响无显著性差异。使用MTT法检测β-榄香烯对肺癌细胞增殖的影响,β-榄香烯的干预能够显著降低A549细胞的增殖。以上结果提示β-榄香烯能够抑制肺癌细胞的增殖和生存。鉴于上述实验结果，我们将选择剂量为200μmol的β-榄香烯以及72h这一时间点用于后续实验。

2β-榄香烯诱导肺癌细胞凋亡细胞经剂量为200μM的β-榄香烯处理，V-FITC/PI染色后，使用流式细胞仪进行检测。观察到经β-榄香烯处理的A549细胞，凋亡细胞数量显著增加。为了解β-榄香烯诱导凋亡的分子机制，我们进一步检测了凋亡相关蛋白的表达。结果显示：β-榄香烯显著下调了Bcl-2 和Bcl-xl的表达(P<0.05)，但对Bax 和Bak的表达影响较少(P>0.05)。

讨　论

肺癌为癌症死亡的首要原因，近年来青年和女性人群发病率及病死率增长迅速，非小细胞肺癌尤其是腺癌所占比重有进一步加大趋势[4]。虽然针对致癌基因靶向药物的出现，腺癌生存期有较大改善，但对于基因突变阴性或耐药的患者仍需要寻求新的方法和药物。

β-榄香烯是从姜科植物温郁金中提取的抗癌有效成分，研究显示：其可通过抑制肿瘤细胞DNA、RNA及蛋白质合成，从而降低肿瘤细胞有丝分裂能力，抑制肿瘤增殖[5]。本实验可见给予β-榄香烯干预后A549和H460存活细胞数目均明显减少，且呈现剂量与时间依赖性，这与以前研究相符合，但两者之间无显著性差异。进一步研究细胞增殖，发现β-榄香烯的干预对降低A549细胞增殖能力显著优于H460。

研究表明：细胞凋亡参与了肿瘤的形成、发展及耐药等环节。人体可通过凋亡途径清除体内异常细胞，维持内环境相对稳定。若凋亡途径受到破坏、抑制或缺失，异己成分不能被清除，则会引起肿瘤及自身免疫系统疾病。细胞凋亡受多基因严格掌控，其中Bcl-2基因家族在其中发挥着重要的作用,其成员包括以Bcl-2、 Bcl-xl为代表的抗凋亡基因及以Bax、Bak为代表的促凋亡基因，两者通过二聚体化过程在线粒体水平上调节细胞凋亡[6]。本实验可见经β-榄香烯干预后A549细胞凋亡明显增多，进一步检测发现Bcl-2、 Bcl-xl均较对照组明显减低，虽然Bax、Bak均较对照组有升高趋势。提示β-榄香烯促进肿瘤细胞凋亡主要是通过下调Bcl-2、 Bcl-xl完成的。

[1]Li L,Xu L,Qu X,etal. Cbl-regulated Akt and ERK signals are involved in-elemene-induced cell apoptosis in lung cancer cells[J]. Molecular Medicine Reports， 2011，4(6): 1243-1246.

[2] Wang P, Henning SM, Heber D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols[J]. PloS One， 2010,5(4): 10202.

[3] Liu B, Peng XC, Zheng XL,etal. MiR-126 restoration down- regulate VEGF and inhibit the growth of lung cancer cell lines in vitro and in vivo[J]. Lung Cancer，2009，66(2):169-175.

[4]刘又宁.呼吸内科学高级教程[M].北京：人民军医出版社，2012:390-415.

[5] 高红军,秦海峰.榄香烯治疗非小细胞肺癌的作用机制研究进展[J].现代医学生物进展,2010,21(10):4149-4151.

[6]史新惠,王芳.肺癌中相关凋亡分子的新近研究进展[J].医学综述，2014,20(10):1729-1732.

(收稿：2015-04-20)

Effect of β-elemene on the proliferation and apoptosis of human lung cancer A549 and H460 cells

Xi’an Central Hospital of Medical School,Xi’an Jiaotong University (Xi’an 710003)

Du XushengYu JunLi Jianyinget al

Objective：To investigate the effect of β-elemene on the proliferation and apoptosis of human Lung cancer cells. Methods： Lung cancer A549 and H460 cells were treated with different concentrations of β-Elemene injection,The cell proliferation was measured by trypanblue stain and MTT. A549apoptosis rate was measured by flow cytometry, the expression levels of apoptosis associated protein were explored by western blot. Results： The proliferation of human lung adenocarcinoma A549 and H460 cell line were inhibited significantly by Elemene and the inhibition was time and dose-dependent.The β-Elemene could promote A549 apoptosis,and lower bcl-2 and bcl-xl protein expression．Conclusion：β-Elemene can inhibit the proliferation and apoptosis by lower bcl-2 and bcl-xl protein expression.

Lung neoplasms/physiopathologyApoptosis@β-Elemene

西安交通大学基础医学院肿瘤研究所

R734.2

Adoi：10.3969/j.issn.1000-7377.2015.09.001

* 陕西省自然科学基金项目(2012JC2-06)

△ 西安交通大学第二附属医院

主题词肺肿瘤/病理生理学细胞凋亡@β-榄香烯