人兽共患旋毛虫病诊断技术的研究进展

叶星宇

(广元市动物疫病预防控制中心,四川广元628017)

人兽共患旋毛虫病诊断技术的研究进展

叶星宇

(广元市动物疫病预防控制中心,四川广元628017)

旋毛虫病是一种严重的人兽共患寄生虫病。旋毛虫的检测方法主要包括实验室检测,免疫学检测和分子生物学检测。目前,主要采用免疫学方法检测旋毛虫病。本文就旋毛虫病诊断技术的研究做一综述。

旋毛虫病;检测技术;研究进展

1 前言

旋毛虫病是由旋毛形线虫引起的一种严重的人兽共患寄生虫病，旋毛虫主要寄生于猪、熊等150多种动物及人。由于其病原传播的复杂性，流行范围广，世界各地区均有发生该病的报道。旋毛虫病不仅给畜牧食品业带来重大的经济损失，而且还严重危害人类的健康。庞颜坤（1999）报道，1964～1997年，仅云南省人群暴发旋毛虫病就达441次，发病20101人，死亡多达213人。因此，旋毛虫的诊断有十分重要的意义。

2 旋毛虫诊断技术

2.1 实验室诊断

2.1.1 解剖分析

旋毛虫“目检”法目检法即用眼睛观察肉样以检旋毛虫，旋毛虫幼虫感染猪体后大约21d～7个月形成钙化，肉眼观察即能检出。操作方法是：将新鲜膈肌脚撕去肌膜，肌肉纵向拉平拉紧，然后在光线较好处仔细观察肌纤维表面，最好稍斜方向去看更易发现，肉眼松本时的光线以自然光源较好，检出率高。

2.1.2 显微镜检测

常用活组织压片镜检、人工胃液消化分离法及动物感染，压片法检。体操作方法是：选取豌豆大小的无脂肪和皮肤的肌肉组织，从每一肉样剪取麦粒大小的肉24粒，均匀地在玻片上排放，用另一玻片压紧在两玻片之间，置于旋毛虫镜检器或显微镜交视野投放到屏幕上观察，发现包囊幼虫即可确诊。（消化法是肌片用胃蛋白酶和稀盐酸消化，离心沉淀后检查幼虫）。

但以实验室诊断方法有摘取组织的局限性，在感染的早期及轻度感染者检出率低，阳性率仅50%左右，且不易被患者接受。

2.2 免疫学诊断

2.2.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）

酶联免疫吸附试验是将可溶性抗原或抗体吸附于固相载体上，利用酶标抗体或抗原结合形成酶标记的免疫复合物，加入相应酶底物显色，根据反应液颜色判定抗原-抗体反应情况，从而检测抗原或抗体。经过长期实践，实验技术的改进，常规的ELISA发展为SPA—ELISA、DOT—ELISA等。黎世涛等用SPAELISA检测旋毛虫法所需的材料制成快速诊断试剂盒，与常规ELISA平行检测107例旋毛虫病人血清，阳性率分别为99.07%和97.19%；人畜血清两法阳性率均为100%。朱名胜等用Dot-ELIST检测旋毛虫病患者38例和感染旋毛虫的豚鼠40例血清，阳性率分别为97.4%和100%。

2.2.2 间接荧光抗体检测技术（IFAT）

间接荧光抗体检测技术是将待检样本（如：血液涂片、组织切片等）固定，加入一抗反应一定时间，用pbs反复洗脱，自然干燥，再加入用荧光标记的二抗反应。再荧光显微镜下观察，根据是否有荧光判断结果。有荧光为阳性，无荧光为阴性。El-Shazly AM等采用IFA和ELISA检测实验感染旋毛虫鼠的IgG水平，在整个实验期间，IFA的敏感性和特异性分别为100%和85%，ELISA的敏感性和特异性分别为100%和93.3%。IFAT法检测旋毛虫病快速、有较高的敏感性和特异性，而且制备的荧光标记抗体，可以用于多种抗原抗体系统的检测。但需配备荧光镜，使其应用范围受到一定的限制。

2.2.3 间接血凝试验（IHA）

间接血凝试验是指将抗原或抗体通过结合剂结合到红细胞表面，再与相应的抗体或抗原结合就会出现肉眼可见的红细胞凝集现象。IHA诊断旋毛虫病有较好的敏感性和特异性，而且具有操作简便，不需特殊设备等优点，具有早期诊断价值。

2.2.4 环蚴沉淀试验（Slide）

将已消化好的纯净幼虫50～100条，置玻片上消毒凡士林制成圆形小凹中，加待检血清1滴，盖上盖玻片，放人潮湿方盘中，在37℃温箱中培养24h，取出玻片用低倍镜观察，是否有幼虫口部或肛门出现透明凝块状或泡沫状的沉淀物附着，判定结果。王绍基等采用IHA和Slide检测旋毛虫病豚鼠血清，阳性率分别为100%和97.1%。用两种方法检测正常豚鼠血清、血吸虫病兔血清、肺吸虫病大白鼠血清、蛔虫病人血清和鞭虫病人血清，除1例肺吸虫病大白鼠血清出现阳性反应外，均为阴性。崔晶等用环蚴沉淀试验与IFAT进行对比试验，检测郑州一起旋毛虫大暴发490名有聚餐史者及212例旋毛虫患者血清阳性率，结果无显著差异。Slide幼虫沉淀物大多附在幼虫尾部呈不太规则的透明凝块状，或附在幼虫口部呈空泡状，有些幼虫口、尾同时附有沉淀物，随幼虫移动而自然摆动，在低倍镜下易于观察。

2.2.5 乳胶-磁性颗粒技术

乳胶颗粒是一种有色悬浮液（如蓝色、红色等），用旋毛虫p49抗原致敏乳胶颗粒，用抗抗体包被磁性颗粒，利用抗原—抗体反应使两种颗粒与阳性抗体形成大分子结合物，在磁场作用下，结合物随着磁性颗粒沉降下来，从而使溶液变清（阴性对照仍为悬浮浊液），通过目测判定结果，必要时也可用仪器检测其清浊度。该检测方法操作简便、时间短、灵敏度高、不需专用设备的快速诊断技术。宋思扬等报道用该技术测定旋毛虫P49抗原抗体，检测到19份感染鼠血清、6份感染猪血清、3份旋毛虫病猪血清、4份病人血清呈IgG抗体阳性，说明融合蛋白P49/GST的乳胶-磁性颗粒技术可用于旋毛虫的早期诊断。

2.2.6 快速免疫层析法

快速免疫层析是在层析材料上包被相应的抗原，采用胶体金技术将处理过的制剂吸附在试纸条上，检测被检血清中的相应抗体。若抗原、抗体相对应，则发生高特异的免疫亲和反应，免疫复合物被截留集聚在一定区域（检测带），通过胶体金而得到肉眼直观的显色带，可判定检测结果。采用胶体金标记Dipstick试纸条检测旋毛虫病患者与旋毛虫感染的小鼠、大鼠、兔、猪血清的阳性率分别为100%（28/28）、96.00%（48/50）、100%（10/10）、100%（10/10）及100%（30/30）；其它寄生虫病（斯氏狸殖吸虫病、血吸虫病、华支睾吸虫病等）患者及正常人血清均为阴性。张月清等采用快速免疫层析法和ELISA法检测旋毛虫病患者及动物，两种检测方法检测感染旋毛虫的感染率一致。快速免疫层析法诊断旋毛虫病具有较高的敏感性和特异性，简便快捷，勿须特殊仪器设备，是一种检测旋毛虫病血清IgG抗体和流行病学调查较好的免疫诊断方法。

此外，还有免疫酶染色试验（IEST）、增强化学发光酶免疫染色试验（ECIA）、皮内试验、循环抗原（CAg）检测、淋巴细胞杂交瘤和单克降抗体（McAb）技术等。虽然旋毛虫的免疫学检测方法很多，由于旋毛虫虫体抗原的结构极其复杂，且在其长期的寄生生活中，逐渐形成了各种各样的免疫逃避手段，采用成分复杂的虫体抗原往往难以取得理想的诊断、预防和治疗效果。

3 分子生物学诊断

3.1 多重PCR技术（multiplex PCR）

聚合酶链式反应（PCR）是20世纪80年代中期发展起来的一种在体外迅速大量扩增特异性DNA的新技术，它具有高度的灵敏性和特异性。Caballero-Garcia ML等用PCR方法对实验感染小鼠进行旋毛虫病早期诊断，结果最早在感染后第3天检测到旋毛虫DNA，在第3～17d，33只实验鼠血样中均检测到旋毛虫DNA。张国华等根据旋毛虫幼虫基因序列设计合成引物，采用PCR检测感染幼虫及健康幼虫，可检测0.01条幼虫产物。

多重PCR敏感性和特异性都相对较高，可鉴别分子差异不明显的虫种。由于可在同一PCR反应管内同时对多个目的基因进行分型，多重PCR还具有系统、经济及简便等优点，尤其适合于大量标本鉴定。近年来此方法广泛应用于旋毛虫的流行病学调查及虫种分类，是旋毛虫分类学及流行病学分离鉴定中十分有用的工具。

3.2 构建旋毛虫cDNA文库

近年来，国内外学者把视线放在基因工程抗原上，通过构建cDNA文库，筛选理想的抗原，预测其抗原表位。探索应用旋毛虫重组抗原进行快速广普旋毛虫检测的新方法。

在众多的旋毛虫抗原中，旋毛虫的排泄分泌（ES）抗原可直接刺激宿主的免疫系统，是诱导宿主产生免疫应答的主要靶抗原。因此，旋毛虫ES抗原作为诊断抗原比较理想。Zaflenga等（1989）用从旋毛虫肌幼虫分离的多聚腺苷酸mRNA构建了cDNA（互补DNA）表达文库，筛选出ES中53KD；Sugane等将获得的T·spiralismRNA反转录合成cDNA表达文库，从而筛选出ES中45～46KDa蛋白的结构基因，基因阳性克隆表达，经检测表明能与旋毛虫病阳性血清发生特异性反应；原丽红等利用p46ku抗原基因的原核表达重组蛋白WN10免疫小鼠，可诱导小鼠产生较强的抗旋毛虫保护性免疫；牛廷献等以从旋毛虫新生幼虫cDNA文库中筛选获得的T668基因表达的重组蛋白为抗原，对小鼠的保护性作用进行了研究，结果显示T668重组抗原具有一定的免疫保护作用，且可激发特异性体液免疫，为旋毛虫病的防治提供了新的免疫原。刘明远等已成功地构建了中国猪旋毛虫和犬旋毛虫（T.nativa）分离株的成虫及新生幼虫混合文库。Chung等构建了伪旋毛虫（T.pseudospiralis）DNA文库，表达了一种23kDa的β-半乳糖苷酶-融合蛋白，免疫细胞定位表明抗该融合蛋白的血清只能识别伪旋毛虫，提示该融合蛋白可作为伪旋毛虫病鉴别诊断的一种特异性抗原。NaganoI等用旋毛虫感染血清从旋毛虫肌幼虫cDNA文库免疫筛选到丝氨酸蛋白酶抑制剂基因和丝氨酸蛋白酶基因。

4 小结

旋毛虫病是一种严重的人兽共患病，威胁人类健康，且对农牧养殖业发展造成严重的经济损失。因此快速诊断疾病，对于治疗和预防具有十分重要的意义。目前旋毛虫病得诊断主要是依靠免疫学诊断，近年来，旋毛虫抗原特别是ES抗原的研究，cDNA表达库的建立等，从分子水平上寻找诊断与控制旋毛虫病的措施奠定了基础，为基因疫苗的研究也奠定了基础。

[1]崔晶，王中全，晋雪香，等.郑州市一起旋毛虫病大暴发的流行病学调查及临床观察[J].中国人兽共患病杂志，1997，13（2）：65.

[2]郑继昌，李治深.旋毛虫血清学诊断研究进展[J].中国兽医寄生虫病，2003，（10）：38-43.