抗氧化作用样中药单体抑制Ox-LDL生成保护血管内皮细胞作用的研究进展

钱春美 张晓峰

(上海中医药大学附属市中医医院，上海，200071)

抗氧化作用样中药单体抑制Ox-LDL生成保护血管内皮细胞作用的研究进展

钱春美 张晓峰

(上海中医药大学附属市中医医院，上海，200071)

氧化低密度脂蛋白(Oxidized Low Density Lipoprotein，Ox-LDL)的形成对动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)的发生发展起到很关键的作用，主要通过刺激相关受体、分泌细胞因子等诱导内皮细胞损伤，加重AS。近年来国内外对中药单体抗低密度脂蛋白氧化，减少对血管内皮细胞损伤，起到预防治疗动脉粥样硬化，保护心血管作用有很多报道。本文就近年来的中药单体抗Ox-LDL，保护心血管疾病的相关研究进行综述。

中药单体；氧化低密度脂蛋白；血管内皮细胞；动脉粥样硬化

心血管疾病是目前严重危害人类健康的疾病之一，它的患病率与死亡率也在逐年提高。动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是心血管疾病的重要病理基础，其发病的过程复杂，血管内皮层作为血管壁的首要防线，其完整性至关重要。近年来大量资料提示Ox-LDL是血管内皮损伤、单核细胞黏附、泡沫细胞形成和血栓形成的主要因素，在AS的发生、发展中发挥重要作用。抗氧化药物(如丙丁酚、他汀类等)通过抑制Ox-LDL生成、进而保护血管内皮细胞已成为治疗AS的一种重要方法，并在临床取得良好疗效。多年以来，天然抗氧化药物一直是研究的热点，而中药中具有抗氧化样的单体也得到深入的研究。

1 Ox-LDL与血管内皮损伤

1.1 氧化、抗氧化与Ox-LDL 天然的LDL本身不足以促发动脉粥样硬化，当其被氧化修饰后，方能有致病作用。主要是通过细胞介导、过度金属离子介导以及一氧化氮氧化、髓过氧化酶氧化等途径，经过迟滞、进展以及分解三个主要阶段形成的。产物Ox-LDL是导致血管内皮细胞损伤，AS发生、发展的关键因素。

根据徐瑞霞综述[1]，迄今为止关于LDL氧化修饰生成Ox-LDL的机制研究主要涉及以下四个方面内容：1)金属离子氧化法：将LDL(50～100 μg/mL)与CuSO4(1～10 μmol)在37 ℃条件下孵育24 h，Ox-LDL生成；2)过氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)的氧化作用：中性粒细胞在防御微生物侵袭时活化并释放MPO，MPO/H2O2/氯化物系统能够生成一系列继发自由基或非自由基类氧化剂，从而对LDL进行氧化修饰；3)糖化LDL：主要存在于糖尿病患者中；4)一氧化氮(Nitric Oxide，NO)及其氧化机制：在生理条件pH值下NO不能氧化LDL，但当环境中存在O2时，NO迅速失活生成潜在的氧化—过氧亚硝酸盐(Peroxynitrite，ONOO-)，此时的NO则起着促进氧化反应的作用，这一机制参与了LDL的氧化修饰。抗氧化剂具有抑制Ox-LDL的形成作用[2]，如抗氧化剂丙丁酚可以进入LDL颗粒抑制LDL的氧化，从而延缓AS的形成，类似作用的药物还有普罗布考等。另外天然抗氧化剂维生素E与维生素C在胆固醇喂饲的新西兰白兔、高脂血症鼠及灵长类动物实验中也表现出具有促进消退原有损伤的作用。

1.2 Ox-LDL致血管内皮细胞损伤机制 主要通过：1)激活血管内皮细胞的跨膜表面糖蛋白(Cluster of Differentiation，CD)36和血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(Lectin-like Oxidized Low Density Lipoproteinrecaptor-1，LOX-1)，引发内皮损伤和炎症反应[3-5]；2)剌激内皮细胞分泌具有很强趋化作用的因子促使单核细胞对血管内皮发生黏附、趋化和浸润受损[6]；3)LDL在氧化过程中产生的脂质过氧化物抑制内皮细胞生长、引起骨架破坏、诱导细胞凋亡并抑制吞噬凋亡细胞、阻碍内皮细胞的自我修复作用[7-8]。

2 抗氧化作用样中药单体抑制Ox-LDL生成、保护血管内皮细胞的作用

2.1 三七总皂苷 三七总皂苷(Total Panax Notogin Senosides，TPNS)是中药三七的主要活性成分，具有良好的调脂、抗氧化、抗血小板聚集作用。刘桂林[9]等将载脂蛋白E基因敲除apoE-KO小鼠进行体内实验，应用ELISA法测定小鼠血清Ox-LDL含量，透射电镜观察小鼠主动脉内皮细胞的超微结构，实时定量RT-PCR检测小鼠主动脉细胞分化抗原40(CD40)血管细胞黏附分子-1(Vascular Cell Adhesion Molecule 1，VCAM-1)mRNA表达水平。结果显示，apoE-KO小鼠的主动脉内皮和正常相比明显肿胀，连续性中断，可见细胞凋亡，胞核固缩核，内异染色质明显增多，线粒体空泡化。用药组内皮结构有不同程度的改善。与模型组相比apoE-KO小鼠血清Ox-LDL水平显著升高。三七总皂苷及辛伐他汀均可显著降低apoE-KO小鼠血清Ox-LDL水平，下调主动脉CD40及VCAM-1的基因表达水平，对动脉粥样硬化小鼠血管内皮具有保护作用。

以培养原代人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell，HUVEC)作为靶细胞，用Ox-LDL造成HUVEC损伤模型，用三七总皂苷进行干预的体外实验证实[10]，三七总皂苷能通过下调内皮细胞表面黏附分子的表达，抑制单核-血管内皮细胞黏附，从而发挥对血管内皮细胞的保护作用。

2.2 川芎嗪 川芎嗪(Ligusteazine)具有活血化瘀等心血管系统的保护作用，其作用机制复杂。王国峰[11]等通过体外培养人冠状动脉内皮细胞，并随机分为对照组、Ox-LDL组、不同浓度川芎嗪为1 μmol/L组、10 μmol/L组、100 μmol/L组。用RT-PCR及Western Blot法检测单核细胞趋化蛋白1(Monocyte Chemotactic Protein-1，MCP-1)和细胞间黏附分子1(Intercellular Adhesion Molecule-1，ICAM-1)基因和蛋白表达；采用免疫荧光法观察NF-κB p65蛋白的核转位。结果显示，不同浓度的川芎嗪能下调MCP-1、ICAM-1基因表达，保护对Ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤。

阮秋蓉等[12]通过体外培养人脐静脉内皮细胞和大鼠胸主动脉平滑肌细胞实验，证实川芎嗪通过抑制或阻断AS危险因素Ox-LDL、Ox-vLDL和血管紧张素II诱导的核因子κB活化及核内移位，抑制血管壁细胞血管细胞黏附分子1和单核细胞趋化蛋白1表达，抑制单核细胞黏附于内皮，而发挥其抗AS作用。人内皮细胞ECVV304的体外实验[13]同样证实，川芎嗪能提高血管内皮细胞超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase，GSH-Px)的活性，抑制Ox-LDL导致的内皮细胞损伤。

2.3 白藜芦醇 白藜芦醇是一种生物性很强的天然多酚类物，是降低血小板聚集，预防和治疗AS、心脑血管疾病的化学预防剂。李国洪[14]等在铜离子诱发LDL氧化修饰的基础上，建立内皮细胞脂质过氧化损伤模型，通过不同剂量的白藜芦醇进行干预。白藜芦醇的干预可减轻OX-LDL对抗超氧化物歧化酶SOD，谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px的影响，降低MDA含量，并显著减少凋亡细胞数量，保护和修复Ox-LDL引起的血管内皮细胞损伤。

2.4 丹参多酚酸盐 丹参多酚酸盐(Salvianolate)是以丹酚酸B镁(或称丹参乙酸镁)为主要成分的有效活性部位，具有很强的抗氧化和清除自由基作用。熊涛[15]等证实其对Cu2+、内皮细胞介导LDL的氧化有显著的抑制作用，达到治疗AS的作用。吴兴利[16]等通过兔血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cell，VSMC)体外实验，研究证实一定浓度的Ox-LDL可促进VSMC分泌白介素IL-18、IL-1和ICAM-1，丹参多酚酸盐可浓度依赖地抑制Ox-LDL刺激产生的IL-1和ICAM-1分泌作用，发挥其对VSMC免疫学功能的调控。

2.5 银杏黄酮苷元 银杏叶提取物中的黄酮苷元(Ginkgo Flavone Aglycone，GA)具有较强的抗氧化活性，何艳[17]等通过前期实验证实黄酮苷元可抑制Ox-LDL诱导内皮细胞表达LOX-1。且进一步实验采用银杏黄酮苷元对兔颈总动脉内皮损伤的干预，4周后检测各组血脂水平，观察各组右颈总动脉形态，用免疫组织化学法和RT-PCR检测LOX-1蛋白和mRNA表达。结果证实模型组术后4周内膜增生明显，有粥样斑块形成，LOX-1表达明显增加。黄酮苷元灌胃后右颈总动脉内膜增生较轻，内膜面积、LOX-1阳性细胞数和其基因表达水平均低于模型组。提示银杏黄酮苷元可通过抑制兔颈总动脉内皮损伤后LOX-1的表达，减轻新生内膜增生及AS的形成。

在GA对Ox-LDL诱导的人主动脉内皮细胞(Humanaorticendothelial Cells，HAECs)氧化应激损伤的保护作用[18]实验证实，GA可明显抑制Ox-LDL诱导的活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)合成，降低丙二醛(Minimum Descent Altitude，MDA)水平，升高NO其作用机制可能与SOD活性增加及内皮细胞NADPH(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate Oxidase，NADPH)氧化酶活性降低有关。

2.6 葡萄籽原花青素 葡萄籽原花青素(Grape Seed Proauthocyanidin Extract，GSPE)是从葡萄籽中分离出来的一类多酚类化合物，是一张强抗氧化剂，对AS、大肠肿瘤、胃溃疡等多种疾病有预防作用。刘相菊[19]等通过GSPE作用兔AS模型，进行MDA、Ox-LDL检测及形态学观察。结果显示经GSPE干预治疗后，形态学观察可见局部破坏减轻，小栓子形成受抑。Ox-LDL含量降低，抑制AS的形成。沈琳[20]等通过含胆固醇颗粒饲料建立AS模型，探讨GSPE对实验性AS兔基质金属蛋白酶2，9(Matrix Metallo Preteinases-2，9，MMP-2，9)和Ox-LDL的影响，结果进一步显示GSPE干预后，MMP-2、MMP-9和Ox-LDL水平明显下降，证实了GSPE有明显的抗AS效应，且效应与其抗氧化、抑制细胞分泌因子有关。

2.7 桔梗皂苷D 桔梗(Platycodon Grandiflorum A.DC.)，桔梗科桔梗属植物，主要活性成分桔梗皂苷D(Platycodin D，PD)。王茂山[21]等利用Ox-LDL诱导HUVECs，建立细胞氧化损伤模型，测定NO、MDA水平和VCAM-1、ICAM-1的表达。结果证实，PD能显著增大细胞培养液NO浓度，显著降低MDA水平。通过减少VCAM-1和ICAM-1分子的表达及单核细胞与内皮细胞的黏附作用来抑制Ox-LDL诱导的内皮细胞氧化损伤，起到治疗AS早期反应。

2.8 西红花酸 西红花酸来源于茜草科植物栀子(Gardenia Jasminoides)果实，为天然类胡萝卜素类化合物。郑书国[22]等人用高脂饲料建立兔高脂血症模型，用西红花酸伴饲料，测定其血清总抗氧化能力及相关活性因子。结果发现，高脂血症能诱导机体的氧化应激状态，损伤机体抗氧化能力，引起LDL氧化修饰。西红花酸能显著降低高脂血症家兔LDL氧化易感性和血清Ox-LDL水平，且有剂量依懒性。

2.9 其他 刘瑞[23-24]等人对天然黄酮类化合物槲皮素、芦丁、葛根素、异鼠李素及橙皮苷对Cu2+介导LDL体外氧化修饰作用的影响。按一次性密度梯度超速离心法分离人血清LDL，分别加入药物与LDL温育3 h，然后利用Cu2+介导体外氧化修饰脂蛋白的方法，观察发现LDL氧化修饰不同时间，这五种黄酮类化合物均具有降低相对电泳迁移率(Relative Electrophoretic Mobility，REM)，硫代巴比妥酸反应物质(Thiobarbituric Acid Reactive Substance，TBARS)及载脂蛋白羰基含量，抑制Cu2+介导LDL氧化修饰的作用。

原儿茶醛是从活血化瘀药物(如丹参、四季青叶、鼠尾草)中提取的水溶性单体，具有扩张动脉、降低心肌耗氧量、抑制血小板聚集、抗脂质过氧化和清除自由基等作用。韩纯洁[25]等人Ox-LDL诱导人血管内皮细胞损伤，并以不同剂量的原儿茶醛干预24 h，用四甲基偶氮唑蓝比色法检测细胞存活数量，比色法测定细胞培养液中NO含量和NOS活性，流式细胞术测定细胞内CD40蛋白表达。检测结果显示，原儿茶醛抑制Ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤，保护血管内皮细胞。

3 讨论

AS是以血管炎症反应为主的慢性血管性疾病，发病原因涉及许多因素。血脂代谢异常导致的高脂血症以及脂质氧化是动脉粥样硬化发生发展过程中起关键作用的致病原因。Ox-LDL通过多种机制诱导血管内皮损伤，是其发生、发展的重要因素。目前，除了一些抗炎药物外，具有抗氧化作用的中药单体通过抑制LDL的氧化，减少Ox-LDL的生成，从而降低内皮细胞损伤和细胞凋亡，并对AS具有明显的防治作用。综上所述，天然中草药植物中存在着有效活性物质抑制Ox-LDL刺激内皮细胞产生的损伤，达到保护心血管作用。因此，具有抗氧化作用的中药提取物有望成为抗AS治疗及预防其进一步发展的重要手段。

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(2014-09-23收稿 责任编辑：张文婷)

Investigation Progress in Chinese Medicine Monomer with Antioxidant Effect Inhibiting Ox-LDL Ggeneration and Protecting Vascular Endothelial Cells

Qian Chunmei, Zhang Xiaofeng

(ShanghaiMunicipalHospitalofTraditionalChineseMedicineAffiliatedtoShanghaiTCMUniversity,Shanghai200071,China)

Oxidized low-density lipoprotein (Ox-LDL) plays an important role in the formation of atherosclerosis (AS). It induces endothelial cell injury and aggravates AS by stimulating the relevant receptors, secreting cytokine and so on. In recent years, there are more and more reports about the antioxidant effect of Chinese medicine monomer in preventing and treating AS by reducing endothelial cell injury. This paper gives a summary review of some researches on the relationship between Ox-LDL and cardiovascular disease in recent years.

Chinese medicine monomer; Ox-LDL; Vascular endothelial cell; AS

上海市卫生局科研项目(编号：20114057)

钱春美，女，硕士，中药师，E-mail：qcm_work@126.com

张晓峰(1961.11—)，男，学士，主任技师，科室主任，研究方向：心血管疾病方向，E-mail：xfzhang0387@sina.com

R285.5；R543.1+2

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.04.040