MicroRNA与非小细胞肺癌

【摘要】肺癌已经成为全球范围内因癌症导致死亡的首要原因，当今由于缺乏有效的指导临床诊断和治疗的肿瘤分子标志物，所以非小细胞肺癌患者的疗效不佳。Micro RNA(以下简称miRNA)是真核生物中一类长度约为22个核苷酸的参与基因转录后水平调控的小分子非编码RNA。miRNA在肺癌中发挥原癌基因及抑癌基因的作用，在肺癌的发生、发展过程中均发挥着重要作用。miRNA不仅可以在石蜡包埋组织和体液中保持稳定，而且在血清和血浆中也可以稳定存在，这个特性使循环miRNA有望成为一种新型分子标志物，为肺癌的早期分子诊断、预测预后及治疗效果开辟了一个新的研究领域。

基金项目:国家自然科学基金(81101773)，北京市科委重大项目(D14110700020000)，首都医科大学基础-临床科研合作基金(14JL25)资助。This study was supported by National Natural Science Foundation of China(81101773); Major Project of Beijing Municipal Science and Technology Commission(D14110700020000); Capital Medical University Foundation-clinical Research Cooperation Fund(14JL25)．* Corresponding author，E-mail: xiuyizhi@ aliyun．com

网络出版时间: 2015－07－16 22∶20网络出版地址: http:∥www．cnki．net/kcms/detail/11．3662．r．20150716．2220．001．html

MicroRNA and non-small cell lung cancer

Tan Xiaogang，Zhi Xiuyi *

(Department of Thoracic Surgery，Xuanwu Hospital，Diagnostic and Treatment Centers of Lung Cancer，Capital Medical University，Beijing 100053，China)

【Abstract】Lung cancer has the highest world-wide cancer mortality．Current therapies for non-small cell lung cancer(NSCLC)patients are inefficient due to the lack of diagnostic and therapeutic markers．MicroRNAs(miRNAs)are a species of small non-coding singlestranded RNA of about 21 nucleotides that through partial sequence homology may interact with the 3’-untranslated region of target mRNA molecules．Recent evidence has shown that miRNA may function as tumor supressors or oncogenes，and alterations in miRNA expression may play a critical role in the initiation and progression of lung cancer．miRNAs are not only stable in paraffin embedded tissues and body fluids，but also in plasma and serum，which makes circulating miRNA a new kind of ideal biomarker that opens a new field for early molecular diagnosis of lung cancer，as well as for prediction of lung cancer survival and therapy．

【Key words】microRNA; circulating miRNA; lung cancer; diagnosis; prognosis; therapy

在世界范围内，肺癌是恶性肿瘤的首位死因，约占恶性肿瘤死因的30% ［1］。根据国家癌症中心全国肿瘤防治研究办公室 ［2］统计，我国年龄标准化后肺癌5年生存率仅为16．1%，由于缺乏有效的指导临床早期诊断和治疗的肿瘤分子标志物，所以肺癌患者的疗效不佳。Micro RNA(以下简称miRNA)是一类广泛存在于动物、植物和病毒中的小相对分子质量的非编码蛋白的RNA分子。成熟的miRNA分子大小为20～25 nt ［3］。目前在人类细胞中约存在1 000多种miRNA(其中经过证实的约400多种)，其数量只占蛋白编码基因的约1%，却调节约30%的基因的表达 ［4-5］。约50%的miRNA定位于在肿瘤中扩增或缺失的染色体脆性位点或区域 ［6］。研究 ［6］证实miRNA表达谱与肺癌的类型、进展、患者生存率及预后等均有密切联系。miRNA可以作为肿瘤抑制因子和癌变的促进因子调控细胞增生、凋亡、侵袭、转移和血管生成等。同一miRNA可影响多种蛋白编码基因，而同一基因又可受多个miRNA影响。miRNA在肿瘤发生发展中的作用及其作为肿瘤诊断、预后标志物及治疗靶点的研究方兴未艾。

1　miRNA的生成及作用机制

miRNA起源于细胞核内，大部分miRNA的编码基因定位于mRNA编码基因的内含子区，还有少数miR-NA的编码区定位于远离mRNA编码基因的DNA区域或mRNA编码基因的3’UTR。miRNA的加工成熟分两步，RNA聚合酶Ⅱ作用下转录出的pri-miRNA(primary-miRNA)长约1 000 bp，具有5’帽结构和3’polyA尾结构以及中间的颈环结构 ［7］; Drosha酶(RNAseIII类的核酸内切酶)酶切作用后成为只有颈环结构的premiRNA(长约60 bp); exportin5/RanGTP将其运输出核后，细胞质中的Dicer(RNAseⅢ类的核酸内切酶)将其酶切成miRNA: miRNA双链结构，经进一步的选择机制解链释放成熟miRNA，成熟miRNA进入核蛋白体复合物miRNP发挥其调节靶基因活性 ［8-10］。在动物细胞中成熟miRNA主要通过与下游靶基因的mRNA的3’UTR以非完全匹配方式结合，干扰和抑制mRNA的翻译;另一种作用机制是将结合的mRNA运输至P-body，在其中脱腺苷酸化作用后，核酸酶对靶mRNA进行酶切降解。

2　miRNA的鉴定

目前检测miRNA的方法主要有RNA印迹(Northern blotting)，实时定量PCR(RT-PCR)，基因芯片技术和二代测序等。

2．1 Northern blotting分析方法

Northern印迹是研究miRNA表达水平最可靠的技术，它常用于在肿瘤细胞中检测miRNA表达水平。从1993年开始，Northern blotting就被用于miRNA基因的研究中，但Northern blotting操作繁琐、样本量需求大、灵敏度较低，不适用于大量临床样本的检测 ［11］。

2．2实时定量PCR

实时定量PCR(RT-PCR)可快速检测出miRNA尤其是Pri-miRNA的表达。2005年RT-PCR被用于222种miRNAs在人类肿瘤细胞系中的表达研究 ［12］。该方法可以定量分析前体miRNAs和非活化的、成熟的miRNAs，但是对于前体miRNAs和成熟miRNAs之间的表达关系，并不是很清楚。由于其具有较高的灵敏度、重复性和特异性，已成为现阶段核酸分子定量检测的金标准，根据引物的不同，RT-PCR可以分为茎环法和加尾法，茎环法特异性较高 ［13］。

2．3 miRNA基因芯片

miRNA基因芯片技术是一种快速有效的检测miRNA表达图谱的方法，它能同时检测多个miRNA。芯片技术的应用实现了在全基因组水平鉴定成熟miRNA的表达。可于短时间内同时鉴定所有已知miRNA的表达谱，成为高通量检测的最佳选择。芯片方法的前提是分离到高质量的miRNA组分，由于存在背景及混杂信号干扰，重复性较差，主要用于miRNA的初筛，其结果还需采用RT-PCR等方法加以验证。

2．4二代测序

新一代大规模测序技术主要用于未知序列miRNA的定量检测，有高通量、准确度高的特性。目前市场上主流的测序技术有454焦磷酸测序技术 ［14］、Solexa合成测序技术 ［15］和SOLID连接测序技术 ［16］，但深度测序价格昂贵，且数据量大，不适用于临床检测，一般用于探寻新的miRNA并对新发现的miRNA进

行功能预测 ［17］。

3　组织miRNA在肺癌诊断中的应用

miRNA在不同组织中有不同的表达。在肺癌组织与正常组织之间以及不同的肺癌组织之间，miRNA表达谱也各不相同，这也为运用miRNA检测以便早期诊断肺癌提供可能。早期研究中，大多数miRNA表达谱的数据从组织样本中获取，尤其是癌组织样本。因为miRNA非常稳定，不易降解，因此，甲醛固定的石蜡包埋组织块可用于miRNA分离 ［14］;从组织样本中得到数据，可以很好的诠释miRNA的疾病参与情况。Yanaihara等 ［18］利用miRNA基因芯片分析法，对104例非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer，NSCLC)组织与正常肺组织进行miRNA表达谱的对比分析发现，有43种miRNA有明显的表达差异，15种miRNA发生上调及28种miRNA发生下调。这些发现均为miRNA在肺癌中的研究奠定了基础。研究 ［19］表明，5种miRNA组合(miR-34c-5p、miR-34a、miR-25、miR-191和let-7a)能够准确地区分肺腺癌和肺鳞癌。Lebanony等 ［20］通过比较122例NSCLC患者标本(62例鳞癌，60例腺癌)表达谱，发现miR-205在区分肺鳞癌和肺腺癌时，对鳞癌的敏感度达96%，特异度达90%，是肺鳞癌高度特异的生物标志。

4　组织miRNA与肺癌的预后

肺癌的预后由多种因素决定，准确的判断预后对于临床治疗具有重要的指导价值。以往的研究 ［21］认为与肺癌预后有关的因素有:年龄、吸烟史、TNM分期、肿瘤的病理类型、肿瘤的分化程度、治疗方式的选择、淋巴结转移等。目前的研究 ［18，22-23］发现，miRNA也能作为肺癌预后判断指标，而且是独立的预后因素。Takalmzawa等 ［22］应用分层聚类法，将143例非小细胞肺癌术后病例分为let-7低表达组(l组)和let-7高表达组(2组)，两组间在年龄、性别、组织学类型、T状态、分化程度上差异无统计学意义。Kaplan-Meier生存曲线显示，1组生存时间明显短于2组，单因素Cox回归分析显示let-7低表达预示着更差的预后。多因素Cox比例风险模型分析显示，let-7的表达水平是非小细胞肺癌术后的独立预后因素，其中1组患者术后死亡的危险比(hazard ratio)是2组的2．71倍。Yanaihara等 ［18］应用单因素Cox模型发现，5种miRNA与肺腺癌预后有关，Kaplan-Meier生存曲线显示，has-miR-155高表达与has-let-7a-2低表达预示着更短的生存期，多因素Cox比例风险模型分析显示，has-miR-155是肺腺癌独立的预后因素。在不同的临床分期，miRNA也能作为判断预后的指标。41例1期肺腺癌患者中，有3种miRNA(hsa-miR-155、hsa-miR-17-3P和hsa-miR-20)表达变化与预后有关，这说明即使是肺腺癌的早期，miRNA检测也能对疾病的预后进行判断。Tan等 ［23］利用miRNA芯片对60例冰冻肺鳞癌与癌旁组织进行了杂交，建立了肺鳞癌特异的miRNA表达谱。发现miRNA-31在肺鳞癌中的表达发生了明显上调，其表达越高，预后越差。Cox回归分析，miRNA-31是其独立预后因素，并用real time-PCR证实。

5　组织miRNA与肺癌的治疗

针对肺癌的治疗，临床应用上主要还是以铂类为基础的双药联合化学药物治疗(以下简称化疗)。提高疗效一方面可通过新药研发，另一方面也可通过提高肿瘤细胞对药物治疗的敏感性实现。已有研究 ［24-26］发现，部分miRNA可提高肺腺癌细胞对抗肿瘤药物的敏感性，如Bian等 ［24］发现，上调miR-451能提高NSCLC(A549)对顺铂的敏感性。Ceppi等 ［25］报道称，下调miR-200表达能够增加NCI-H1299细胞对顺铂和西妥昔单抗的抵抗性。Weiss等 ［26］发现miR-128b杂合性丢失的肺癌细胞对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)吉非替尼十分敏感，而miR-128b未丢失的肺癌细胞H520对吉非替尼敏感性不强。而且临床试验证实，miR-128b杂合性丢失的肺癌患者经吉非替尼治疗后，中位生存期为23．4个月，明显高于miR-128b未丢失患者的10．5个月。因此联合基因剔除和吉非替尼治疗肺癌可使肺癌患者获得更好的疗效。另一项研究 ［27］发现，无论是否吸烟、EGFR是否突变(突变型对EGFR-TKI敏感)，低表达miR-21联合EGFR-TKI均可诱导肺癌细胞的凋亡，提示miR-21可能成为肺癌靶向治疗的有效靶点。此外，Cui等 ［28］观察到，在对多西他赛耐药的肺腺癌细胞中，miR-let-7c的表达明显下调，而额外增加其表达可增加细胞的放化疗敏感性;相反地，应用针对let-7c的抑制剂可降低肿瘤细胞的放化疗敏感性。在肺腺癌的化疗耐药分子机制研究中，let-7c起着重要的作用。针对EGFR基因突变型的肺腺癌患者，酪氨酸激酶抑制剂如吉非替尼有效率高，不良反应小，已经可替代化疗作为二线或三线治疗的选择。

6　循环miRNA与肺癌

目前，肿瘤的早期诊断，特别是非侵袭性的早期诊断方法逐渐受到重视。通过检测血液中的核酸或蛋白，对易感人群进行早期筛查成为目前肿瘤诊断研究的热点。研究 ［29］发现，miRNA表达谱在血清和血浆中差异无统计学意义。miRNA在血清中稳定，能抗RNA酶降解，肿瘤的miRNA能够进入血液循环，血液中的miRNA量可以在一定程度上反映肿瘤的大小，因此有望通过测量血液中的miRNAs来诊断、监测肿瘤。循环miRNA可稳定存在于血液中的原因可能包括:(1)血浆中的绝大多数miRNA与脂类或脂蛋白复合物结合，从而免受核糖核酸酶的降解 ［30］;(2)循环miRNA由相应组织分泌后被微囊泡等载体捕获，进而运载至受体细胞发挥作用 ［31］;(3)循环miRNA主要与Ago2蛋白等RNA相关蛋白结合形成复合物而稳定存在于血液中 ［32］。虽然循环miRNA在血液中的存在形式尚有争议，但其具有的良好稳定性已被大家认可。自1999年与肿瘤相关的miRNA从乳腺癌、结肠癌患者血清或血浆中检测出来至今 ［30］，检测血液中cirDNA用于诊断恶性肿瘤已成为近年的研究热点课题之一。循环miRNA良好的稳定特性使其作为一种新兴的非侵入性生物标志物为肺癌的早期诊断、治疗及预后判断提供了新的思路。6．1循环miRNA与肺癌诊断

近几年，进行低剂量胸部CT对有吸烟史的肺癌高危人群早期筛查是减少高危人群癌症病死率的有效措施。然而由于低剂量胸部CT高假阳性率，目前还无法运用低剂量胸部CT对高危人群中无症状的肺癌患者进行明确诊断。利用miRNA在肺癌组织中的高特异性，意大利的研究者进行了一项大规模研究 ［33］发现，仅选取血中24个miRNAs对肺癌的早期诊断率其灵敏度87%，特异度81%，阴性预测值高达99%，而低剂量胸部CT对于肺癌早期诊断率分别为灵敏度79%，特异度81%，阴性预测值为19．4%。将两者结合来对肺癌进行早期诊断，其假阳性率大大下降至3．7%。Chen等 ［34］在肺癌患者血清中发现了63种在健康人血清中不存在的miRNA，其中10种为肺癌所特异的，并在后续对400例NSCLC患者及220例健康对照者的回顾性研究发现在临床诊断NSCLC之前的33个月，使用上述10 种miRNA就可鉴定出相应的血清样本。Gilad等 ［35］对451例不同类型的肺癌患者的研究显示，miRNA可作为一种非侵袭性的诊断方法来区分肺癌的病理类型，与病理学结果比较，其鉴别鳞状细胞癌、非鳞癌的NSCLC、类癌、SCLC的精确度高达94%。6．2循环miRNA与肺癌预后

Van der Drift等 ［36］进行了一项长达6．5年的随访研究，结果显示首次诊断NSCLC时，血浆循环DNA水平高往往提示患者预后差。Sirera等 ［37］对446例Ⅲ和Ⅳ期的NSCLC患者进行平均为期9．7(15～45)个月的随访研究显示，循环DNA是患者进展中位时间和总生存率的独立预测标志物，它是一种非侵袭性的预测进展期NSCLC患者预后的标志物。Hu等 ［38］研究了肺癌患者血清miRNA表达谱与生存期之间的关系。按生存时间将303例Ⅰ～Ⅲa期NSCLC患者分为长存活组(30例，平均生存期49．5个月)和短存活组(30例，平均生存期9．54个月)，比较两组血清miRNA水平，根据其中差异有统计学意义的4种microRNA(miRNA-486、miRNA-30d，miRNA-l，miRNA-499)组成的表达谱，将患者分为高危组和低危组，低危组中位生存期明显高于高危组(18．43个月vs尚未达到，P＜0．0001)，提示这4种血清microRNA组成的表达谱可用于生存预测，是影响NSCLC患者总生存的独立预后因素。Silva等 ［39］采用芯片技术检测发现，血清miR-30-3P和let-7f的浓度与肺癌患者的无病生存率和总生存率显著相关;血清miR-30-3P和let-7f的高水平表达与肺癌患者预后不良相关。Kaduthanam等 ［40］通过检测早期可切除肺腺癌患者血清中的miRNA水平，证实miR-142-3p与肿瘤的复发高风险相关，在术后24个月内复发的患者，其水平往往升高，提示miR-142-3p可能作为一个评价复发风险的血清指标。

6．3循环miRNA与肺癌治疗

Wei等 ［41］对35例晚期NSCLC行2～3周期的含铂方案化疗后评估疗效，其中11例部分缓解(partial response，PR)，13例疾病进展(progressive disease，PD)，11例病情稳定(stable disease，SD)，化疗无效的PD和SD患者的血清miR-21明显高于化疗有效的PR患者(P=0．049)，血清miR-21在化疗有效的PR患者与对照组间差异无统计学意义(P=0．130)，提示血清miR-21表达可能与NSCLC患者的化疗敏感性有关。Cui等 ［42］采用RT-PCR技术对260例以铂类治疗为主的晚期NSCLC患者和260例健康成年人血浆中的miRNA(miR-125b，miR-10b，miR-34a及miR-155b)进行检测，发现与健康成年人相比，4种循环miRNA在NSCLC患者血浆中的表达明显增高，而且miR-125b在低分化肺癌中的表达明显高于高、中分化者，但miR-10b、miR-34a及miR-155b在不同分期的肺癌患者血浆中的表达水平差异无统计学意义。研究人员还发现在检测的4种循环miRNA中，只有miR-125b在无治疗反应的患者血浆中高表达，这表明miR-125b与治疗反应有显著关系。这一研究结果对于NSCLC靶向治疗的开展具有非常重要的临床意义。

7　痰液及胸腔积液中miRNA的研究

研究 ［43］报道在人血清、血浆、尿液、唾液及其他体液中均有miRNA表达。肺癌患者痰液也是值得留取和检测的有价值的标本。Xing等 ［44］对6个miRNA进行RT-PCR检测，结果表明联合3个miRNA : miR-205、miR-210、miR-708用以诊断肺鳞癌的敏感度和特异度分别为76%和96%。联合4个miRNA: miR-21、miR-486、miR-375、miR-200b，在诊断肺腺癌时的敏感度和特异度分别是80．6%和91．7% ［45］。

Han等 ［46］比较了107例包括良性胸腔积液及肺腺癌导致的恶性胸腔积液病患中胸腔积液的miRNA水平，发现相对于良性胸腔积液患者，miR-198在恶性胸腔积液中被下调，而在与肺腺癌的传统肿瘤标志物例如CEA、CYFRA21-1的比较中，其诊断价值与CEA相当，但略优于CYFRA21-1，miR-198诊断恶性胸腔积液的敏感度为89．2%，特异度为85．0%。

8　小结

综上所述，miRNA几乎参与肺癌发生、发展的全过程，在肺癌的诊断、预后及治疗中都具有重要的作用。循环miRNA分子作为一种新的生物学标志物具有创伤小、可重复、易获取的优点，可用于预测肺癌患者化疗疗效及动态监测治疗效果，并可作为治疗靶标 ［47］。但肺癌相关特异性miRNA表达谱的筛选、检测方法及检测程序的标准化、适合的内参基因的选择等仍是今后血清miRNA研究中需要解决的问题。虽然相关研究尚处于起步阶段，相信随着检测方法的成熟和研究的深入，血清microRNA未来会在肺癌的预测、诊断、预后评估、个体化治疗等方面拥有美好的应用前景。