心脑健片紫外分光光度计法的分析方法验证

于 泳 司马哲超

（东南大学成贤学院，江苏南京210088）

0 引言

一般来说，在药品质量管理活动中，为了确保质量控制的分析方法符合检验要求，满足GMP的要求，并能让客户感到满意，凡是涉及分析方法的领域都应对其分析方法进行验证。

1 问题的提出

国际人用药品注册技术国际协调会议（ICH）在其质量指导文件Q2a中将分析方法分为鉴别、定量分析、限度检测与含量分析4种常见类型，每种类型及其典型的验证参数如表1所示。其中，－表示通常不需要验证的参数；+表示通常需要验证的参数；①表示假如已论证重现性，可不需再论证中间精密度；②表示缺乏专属性的分析方法，应由其他分析方法来补充；③表示视具体情况而定。各类验证参数定义如表2所示[1]。

表1 验证类型与相应参数

表2 验证参数与表示方法

某药品生产企业的主要产品为中药心脑健片，其主要成分为茶叶提取物，根据2010版中国药典，用紫外—可见分光光度法，在540 nm波长处测定吸光度。从检测情况来看，所生产的片剂主药含量符合标准，根据新版GMP的要求，必须对这个检验方法进行方法学验证。

2 方法学验证的实验内容

心脑健片的成分为茶叶提取物，为显淡黄褐色至棕褐色的片剂。此次试验对“20130301”和“20131001”2件批号的心脑健片样品进行了验证及研究[2]。

2.1 含量测定

实验步骤：取本品20片，研细。精密称取适量（约相当于茶叶提取物0.1 g），置100m L量瓶中，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液1m L，置25m L量瓶中，加水4m L、酒石酸铁溶液（去硫酸亚铁1 g，酒石酸钾钠5 g，加水溶解并稀释至1 000m L）5m L，摇匀；再加pH 7.5的磷酸盐缓冲液［甲液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）23.377 g，用水溶解并稀释至1 000m L，摇匀；乙液：称取磷酸二氢钾（KH2PO4）9.078 g，用水溶解并稀释至1 000m L，摇匀。取甲液85m L与乙液15m L，混匀，摇匀，即得］至刻度，摇匀。以水为空白对照，照紫外—可见分光光度法（中国药典2010年版一部附录VA），在540 nm波长处测定吸光度。

计算公式：

本品的含茶叶提取物以茶多酚计，为标示量的90.0%～110%（内控为95%～105%）。取样品重量为0.252 2 g、平均片重为0.273 99 g的心脑健片样品，测出其540 nm处波长和含量如表3所示。

取样品重量为0.270 8 g、平均片重为0.273 99 g的心脑健片样品，其测出540 nm处波长和含量如表4所示。

表3 540 nm处波长和含量（样品重量为0.252 2 g、平均片重为0.273 99 g）

表4 540 nm处波长和含量（样品重量为0.270 8 g、平均片重为0.273 99 g）

实验结论：经过540 nm处波长测定，计算出的样品的茶多酚含量为95.3%、97.4%，既满足国家标准，也满足内控标准，为合格产品。

2.2 专属性

鉴别试验：取本品20片，研细。精密称取适量（约相当于茶叶提取物0.1 g），加水100m L，搅拌，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液2m L，滴加三氯化铁1滴，滤液呈蓝黑色。取上述剩余滤液2m L，滴加香草醛试液（临时用配制）1m L，呈樱红色。结论：滴加三氯化铁滤液呈蓝黑色，滴加香草醛试液呈樱红色，主药与辅料、杂质等能明显区分，表明其专属性良好。

2.3 精密度

重复性测定实验步骤：取本品20片，研细。精密称取0.147 5 g，置100m L量瓶中，摇匀，滤过，弃去初滤液，重复精密量取续滤液1m L 3次，分别置于25 m L量瓶中，加水4 m L、酒石酸铁溶液5 m L，摇匀，再加pH7.5的磷酸盐缓冲液至刻度，摇匀，以水为空白对照，照紫外—可见分光光度法（中国药典2010年版一部附录VA），每组在540 nm波长处测定3次，得到其吸光度，计算其含量和RSD（平均片重为0.291 8 g），其计算结果如表5所示。

表5 精密度测定结果（片重为0.291 8 g）

同上述实验步骤，精密称取0.254 3 g样品，配置成上述溶液，于540 nm波长处测定其吸光度。其计算结果如表6所示。

表6 精密度测定结果（0.254 3 g样品）

同上述实验步骤，精密称取1.252 3 g样品，配置成上述溶液，于540 nm波长处测定其吸光度。计算结果如表7所示。

实验结论：经过对不同浓度的心脑健片在较短间隔内的重复性测定，发现其相对标准偏差RSD为1.6%、0.5%、0.1%，RSD≤2%，满足中国药典对于紫外分光光度计的要求，表明其精密度良好。

2.4 线性

实验步骤：取本品20片，研细。精密称取0.2595g，置100m L量瓶中，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液，配置浓度为0.025mg/m L、0.05 mg/m L、0.2 mg/m L、0.25 mg/m L、0.4 mg/m L的供试品，之后再540 nm处测定其吸光度，构建线性曲线，求出线性方程和R值，如表8所示[3]。

实验结论：浓度与吸光度的线性关系如图1所示，此次线性实验所做的5个浓度均在线性范围内，其相关系数R2值为0.997 1，满足线性关系，线性回归方程为y=3.207 6x-0.019 2，且在含量测定中所

表7 精密度测定结果（1.252 3 g样品）

表8 线性测定结果

做的2个含量值也在线性范围内，具有良好的线性关系[4]。

图1 浓度与吸光度的线性关系

2.5 范围

实验步骤：取本品10片，研细，精密称取10个样品，分别置于100m L容量瓶中，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液1m L，分别置于25m L容量瓶中，加水4 m L、酒石酸铁溶液5 m L，摇匀，再加pH7.5的磷酸盐缓冲液至刻度，摇匀，以水为空白对照，照紫外—可见分光光度法（中国药典2010年版一部附录VA），每组在540 nm波长处测定3次，得到其吸光度。

计算其含量均值和标准差S，以及标示量与均值之差的绝对值A（A=|100-X|）。如A+1.80S≤15.0，即供试品的含量均匀度符合规定；若A+S＞15.0，则不符合规定；若A+1.80S＞15.0，且A+S≤15.0，则应另取20片（个）复试。根据初、复试结果，计算30片（个）的均值X、标准差S和标示量与均值之差的绝对值A，如A+1.45S≤15.0，即供试品的含量均匀度符合规定；若A+1.45S＞15.0，则不符合规定。计算结果如表9所示[5]。

实验结论：标准差S为2.089，绝对值A为2.5，A+1.80S≤15.0，供试品的含量均匀度符合药典标准[6]。

表9 范围测定结果

3 深入研究

为探究各个因素对心脑健片的影响，故设计三因素三水平的正交实验对水温、过滤方式及震荡时间进行了测定，因素水平表如表10所示。

表10 因素水平表

实验步骤：精密称取1.248 8 g样品，置于500m L的容量瓶中，加水，摇匀，分别精密量取3次100m L的样品溶液，放入100m L容量瓶中，设水温为A，过滤方式为B，震荡时间为C，在不考虑交互作用的情况下，分别在540 nm处测定A1B1C1、A1B2C2、A1B3C3、A2B1C2、A2B2C3、A2B3C1、A3B1C3、A3B2C1、A3B3C2的波长，测定实验结果如表11所示。L9（34）正交试验结果效应曲线如图2所示。

实验结论：根据表11的极差R值大小，可以看出因子2对试验结果的影响最大，即过滤方式对试验影响最大，而其中又以因子3离心过滤更加突出，之后是因子1水温以37℃为最具影响，最后因子3震荡时间中1 h最具影响。因此，可初步估计最优方案为A2B3C2；再进一步分析，通过表11可以看出，3个因素一个都没有超过F临界值，即它们都不是显著性因素，但是相对来说因子2的F值要大于因子1和因子3。所以，可以认为三者中最具显著性的便是因素2过滤方式，根据图2效应曲线图，很明显因素1水温到了一个点之后效应便开始下降，因素3时间也是，只有因素2仍在缓慢上升，因此因素2过滤方式仍可继续研究，提升工艺。通过分析，确定在此次的正交试验中A2B3C2是最优方案[7]。

表11 正交实验测定结果

续表

图2 L9（34）正交试验结果效应曲线图

4 结语

上述方法表明，确认应用此分析方法分析心脑健片含量、专属性、精密度、线性、范围指标都符合紫外-分光光度法的常规要求和药典要求，因此该方法可以满足心脑健片日常含量的测定要求。

［1］霍秀敏.化学药物分析方法验证的内容和评价［J］.中国新药杂志，2009（10）

［2］成海平.指导原则解读系列专题（七）化学药物质量控制分析方法验证的原则和要求［J］.中国新药杂志，2009（8）

［3］覃淑芬.质量标准分析方法验证方案——以单硝酸异山梨酯注射液为例［J］.企业科技与发展（上半月），2013（6）

［4］柴逸峰，纪松岗，张国庆，等.2000年版中国药典附录XⅨA“药品质量标准分析方法验证”的探讨［J］.中国药品标准，2002（2）

［5］梁毅.欧美药物进口注册文件中的分析方法验证［J］.医药工程设计，2007（5）

［6］ Taverniers I,De Loose M,Van Bockstaele E.Trends in qual ity in the analytical laboratory.II.Analyt ical method val idation and qual ity assurance［J］.TrAC Trends in Analytical Chemist ry，2004（8）

［7］陈斌.醋酸奥曲肽微球工艺优化及其验证［D］：［硕士学位论文］.吉林大学，2013