黄山野菊花挥发油体外抗氧化活性

赵秀玲，文飞龙，李长龙

(黄山学院生命与环境科学学院，安徽 黄山，245021)



黄山野菊花挥发油体外抗氧化活性

赵秀玲，文飞龙，李长龙

(黄山学院生命与环境科学学院，安徽 黄山，245021)

以ABTS自由基、DPPH自由基和NaNO2的清除作用为指标，评价黄山野菊花挥发油体外抗氧化活性。结果表明：黄山野菊花挥发油对ABTS自由基、DPPH自由基和亚硝酸钠有清除作用的IC50值分别为74.75，97.44，45.60 μL。黄山野菊花挥发油对ABTS自由基、DPPH自由基和亚硝酸钠的清除能力均高于0.1 g/L Vc。黄山野菊花挥发油具有较好的体外抗氧化活性。

黄山野菊花；挥发油；体外抗氧化活性

自由基在信号传导和免疫等方面具有重要的作用，但过多的活性氧自由基就会产生破坏行为，通过链式反应攻击细胞内或体液中的生物分子，如：DNA，脂质，蛋白质等[1，2]。自由基极不稳定，时刻伺机寻找可以结合的分子，一旦和其它分子结合会损害正常细胞，甚至于产生新的细胞——肿瘤细胞。亚硝酸盐广泛存在于自然界环境和食物中，在体内亚硝酸盐会转化为亚硝胺，亚硝胺是目前世界上公认的三大强致癌物之一，能通过胎盘和乳汁引发后代肿瘤，它可以在人体中合成，是一种很难完全避开的致癌物质[3]。

黄山野菊花产于皖南黄山山脉，为菊科植物ChrysanthemumindicumL.的干燥头状花序，中国药典2010年版已把其收入其中，具有清热解毒、疏风平肝之功效，用于治疗疮、痈肿、丹毒、风热感冒、咽喉肿痛、高血压、眩晕、头痛等。现状药理研究表明：野菊花具有广谱抗菌、抗病毒、降压、增加冠脉血流量、清除氧自由基等作用[4]。野菊花中富含黄酮类，有机酸类、萜类、挥发油等化学成分[5]。本次研究以Vc和BHT作为阳性对照，研究黄山野菊花挥发油对DPPH自由基、ABTS自由基和NaNO2的清除能力，并研究其抗氧化作用，以期为黄山野菊花的保健功能和开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄山野菊花购自黄山市茶叶市场,经黄山学院生命与环境学院潘健博士鉴定为菊科植物ChrysanthemumindicumL.的干燥头状花序。1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH)(梯希爱(上海)化成工业发展有限公司生产)；2，2-联氮基-双-C3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐(ABTS)Regal Biotechnology Company；其他试剂均为国产分析纯。

挥发油提取器；UV754N紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司生产)。

1.2 方法

1.2.1 黄山野菊花挥发油的提取 准确称取粉碎后的黄山野菊花样品20 g，置于烧瓶中，用挥发油提取器按水蒸汽蒸馏法提取6 h，得到具有浓郁香味的淡黄色透明油状物。无水硫酸钠干燥后用丙酮稀释成体积分数为0.20的黄山野菊花挥发油，备用。

1.2.2 黄山野菊花挥发油对DPPH自由基清除作用的测定[6，7]取20，40，60，80，100 μL的体积分数为0.20的黄山野菊花挥发油，然后依次加入丙酮80，60，40，20，0 μL，加入24 mg/L的DPPH乙醇溶液(体积分数0.95)4 mL，避光2 h，在波长517 nm处测吸光度(Ai)，以不加样品的DPPH乙醇为对照，测定对照组的吸光度(A0)。IC50 值定义为清除50%自由基所需的样品质量浓度(或体积数)，其计算是通过获得的DPPH自由基回归方程所得。以0.1 g/L Vc为对照，按照上述相同的方法测定其对DPPH自由基的清除率。以黄山野菊花挥发油和Vc的用量(μL)为横坐标(x), DPPH自由基清除率为纵坐标(y)作图，分析黄山野菊花挥发油对DPPH自由基的清除能力。清除率=(1-Ai/A0)×100%。

1.2.3 清除NaNO2能力的测定 按文献[8]的方法测定黄山野菊花挥发油对NaNO2的清除率。将0.5 g/L的柠檬酸钠-盐酸缓冲液(pH 3.0)5.0 mL置于10 mL容量瓶中，加入1.0 mL 100 mg/L的NaNO2溶液和20，40，60，80，100 μL体积分数为0.20黄山野菊花挥发油，用蒸馏水定容至刻度，37 ℃下反应1 h。取1 mL反应液加入4 g/L对氨基苯磺酸溶液2 mL和2 g/L N-1-萘乙二胺盐酸盐1 mL，摇匀放置15 min，在540 nm处测吸光度值Ax；同时做对照实验测其吸光度A0。以0.1 g/L Vc为阳性对照，按照上述相同的方法测定其对NaNO2的清除率。清除率=[(A0-Ax)/A0]×100%。

以黄山野菊花挥发油和Vc的用量(μL)为横坐标(x)，NaNO2清除率为纵坐标(y)，作图分析黄山野菊花挥发油对NaNO2的清除能力，并由NaNO2的回归方程计算IC50。

1.2.4 黄山野菊花挥发油对ABTS自由基清除作用[9]采用文献[9]的方法，并加以改进。将等量7.00 mmol·L-1ABTS溶液与2.45 mmol·L-1过硫酸钾混合，置于暗处12～16 h。用甲醇将ABTS溶液稀释，在734 nm吸光度0.70±0.02。取20，40，60，80，100 μL体积分数为0.20的黄山野菊花挥发油，加入80，60，40，20，0 μL丙酮定容，加入2 mL ABTS溶液，6 min后测量在波长734 nm的吸光度(Ai)；以2 mL丙酮代替ABTS溶液，测定吸光度(Aj);测定2 mL ABTS溶液与100 μL丙酮混合后的吸光度(A0)。清除率=[(A0-Ai+Aj)/A0]×100%。以0.1 g/L Vc为对照，按照上述相同的方法测定其对ABTS自由基的清除率。

以黄山野菊花挥发油和Vc的用量(μL)为横坐标(x)，自由基清除率为纵坐标(y)，作图分析黄山野菊花挥发油对ABTS自由基的清除能力，并由ABTS自由基回归方程计算IC50。

2 结果与分析

2.1 黄山野菊花挥发油对DPPH自由基的清除率

水蒸汽蒸馏法提取到的野菊花挥发油为有浓郁香味的淡黄色透明液体，提取率为0.46%。

DPPH自由基是一种被广泛使用的用来测定生物材料抗氧化活性的稳定的色原物质[10]，在有机溶剂中是一种稳定的、以氮为中心的质子自由基，广泛用于天然产物抗氧化活性的研究[11]。在清除DPPH自由基实验中，抗氧化剂对DPPH自由基的清除能力表现为它们提供氢质的能力[12]。本次试验中，随着黄山野菊花挥发油和Vc使用量的增加，对DPPH自由基的清除作用逐渐增强，两者呈量效关系，但随着黄山野菊花挥发油和Vc使用量的增加，清除率增加幅度逐渐降低(图1)。体积分数为0.20的黄山野菊花挥发油对DPPH的清除效果优于0.1 g/L Vc。当使用量为20 μL时，黄山野菊花挥发油对DPPH清除率是Vc的1.81倍。体积分数为0.20的黄山野菊花挥发油的使用量(X)与对DPPH的清除率(Y)之间的回归方程为Y=18.667+0.322X(R2=0.950 7); 0.1 g/L Vc的使用量(X)与对DPPH的清除率(Y)之间的回归方程为Y=15.156+0.209X(R2=0.719 6)。

图1 黄山野菊花挥发油对DPPH自由基的清除作用

抗氧化剂清除自由基的能力以半数抑制浓度(IC50)来比较，其定义为：使自由基数目减少50%时所需要样品浓度(或体积)。经计算，体积分数为0.20的黄山野菊花挥发油、0.1 g/L Vc的IC50分别为97.444，166.320 μL。与0.1 g/L Vc比较，体积分数为0.20的黄山野菊花挥发油清除DPPH自由基的效果更好。

2.2 黄山野菊花挥发油对NaNO2的清除作用

由于过度使用氮肥，食物原料中的硝酸盐含量经常偏高，转化为亚硝酸盐之后，可能和蛋白质产物合成亚硝胺，成为诱发胃癌等癌症的隐患。当黄山野菊花挥发油使用量在20～40 μL时，随着使用量的增加，对NaNO2清除率迅速增加，此时加入的黄山野菊花挥发油量较少，挥发油完全溶解在溶液中，完全和NaNO2反应，所以清除率增幅很快(图2)。黄山野菊花挥发油使用量在40～100 μL时，随着使用量的增加，对NaNO2的清除作用也在逐渐增加，但是增长速率下降。随着使用量的增加，清除率呈缓慢增长趋势。体积分数为0.20的黄山野菊花挥发油的使用量(X)与对NaNO2的清除率(Y)之间的回归方程为Y=36.883+0.287 7X(R2=0.709 2); 0.1 g/L Vc的使用量(X)与对NaNO2的清除率(Y)之间的回归方程为Y=5.062+0.153 3X(R2=0.926)。经线性回归计算，体积分数为0.20的黄山野菊花挥发油与0.1 g/L Vc的IC50分别为45.601，293.134 μL。可见体积分数为0.20的黄山野菊花挥发油对NaNO2的清除能力明显优于0.1 g/L Vc。

2.3 黄山野菊花挥发油对ABTS的清除作用

Miller等[13]在1993年首次介绍了用ABTS自由基法来评价一些化合物的抗氧化活性，即根据待测化合物清除ABTS自由基引起的吸光度变化来评价其抗氧化活性。在反应体系中，ABTS经氧化后生成相对稳定的蓝绿色ABTS水溶性自由基。抗氧化剂与ABTS自由基反应后使其溶液褪色，特征吸光度降低，吸光度越低，表明所检测物质的总抗氧化能力越强[14]。在测定的体积范围内，黄山野菊花挥发油和Vc对ABTS自由基的清除率随着使用量的增加而增大，使用量与对ABTS自由基的清除率存在较好的量效关系。体积分数为0.20的黄山野菊花挥发油的使用量(X)与对ABTS自由基的清除率(Y)之间的回归方程为Y=25.321+0.330 15X(R2=0.995 6)；0.1 g/L Vc的使用量(X)与对ABTS自由基的清除率(Y)之间的回归方程为Y=4.228+0.598 1X(R2= 0.982 0)(图3)。尽管黄山野菊花挥发油与Vc对ABTS自由基清除过程中的变化趋势相同，但相同条件下，黄山野菊花挥发油对ABTS自由基的清除能力仍然大于Vc对ABTS自由基的清除能力。在使用量为100 μL时，体积分数为0.20的黄山野菊花挥发油与0.1 g/L Vc对ABTS自由基的清除率分别为58.36%，53.10%。经计算，体积分数为0.20的黄山野菊花挥发油和0.1 g/L Vc的IC50分别为74.751，76.529 μL。

图2 黄山野菊花挥发油对亚硝酸钠的清除作用 图3 黄山野菊花挥发油对ABTS自由基的清除作用

3 结论与讨论

许多疾病如炎症、缺血-再灌入损伤、动脉硬化、老年痴呆症和帕金森症都与活性氧引起的生物大分子损伤有关，是自由基生成-清除体系不平衡导致的[15]。当前使用抗氧化剂主要是人工合成的，如BHA，BHT等，这些抗氧化剂在提高产品稳定性和保持品质等方面效果显著，但它们存在很多弊端，还会对人体造成潜在伤害。人们越来越倾向于天然抗氧化剂的使用。本次研究采用了3种国内外常用的体外抗氧化活性检验方法(DPPH法、清除NaNO2法、ABTS法)评价了黄山野菊花挥发油的抗氧化活性。结果表明，体积分数为0.20的黄山野菊花挥发油具有一定抗氧化活性，使用量与抗氧化活性存在量效关系。体积分数为0.20的黄山野菊花挥发油在一定使用量范围内(20～100 μL)对DPPH，NaNO2，ABTS均有一定的清除作用，且清除效果与使用量有剂量效应关系。随着黄山野菊花挥发油使用量的增加，其清除DPPH，NaNO2，ABTS的能力逐渐增强，且其清除自由基的能力均高于0.1 g/L Vc对DPPH，NaNO2，ABTS的清除能力。但黄山野菊花挥发油对DPPH自由基，NaNO2，ABTS自由基的清除作用不同，其IC50分别为97.444，45.601，74.751 μL。黄山野菊花挥发油有较好的体外抗氧化活性，具有开发天然抗氧化剂的潜力。

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(责任编辑：朱宝昌)

In Vitro Antioxidant Activity of Volatile Oil fromChrysanthemumIndicumL. of Huangshan

ZHAO Xiu-ling，WENG Fei-long，LI Chang-long

(College of Life and Environment Science,Huangshan University, Huangshan Anhui,245021,China)

In vitro antioxidant activity ofφ(volatile oil)=0.20 volatile oil fromChrysanthemumIndicumL. of Huangshan was evaluated by scavenging capacity against DPPH，ABTS，sodium nitrite. The results showed that the IC50 values of scavenging capacity against DPPH，ABTS，sodium nitrite were 74.75，97.44，45.60 μL. Scavenging capacity against ABTS and DPPH were higher than that of 0.1 g/L Vc, but the scavenging capacity against sodium nitrite of volatile oil were significantly higher than that of 1 g/L BHT. The volatile oil fromChrysanthemumIndicumL.of Huangshan had good in vitro antioxidant activity. It is worth to develop for application.

ChrysanthemumIndicumL.;volatile oil;in vitro antioxidant activity

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2015.01.011

赵秀玲(1973-)，女，讲师。主要研究方向：食品功能性质。

2013年黄山学院校级科研项目(项目编号：2013xkj002)。

2014-09-21; 修改稿收到日期: 2014-11-28

R284.1

A

1672-7983(2015)01-0057-04