CTX联合BUS对小鼠卵巢及早期肺损伤的研究

沈艳玲等

[摘要] 目的 旨在研究CTX联合BUS对Wister小鼠卵巢及早期肺功能损伤组织结构的影响。 方法 选取2～3月龄的雌性Wister小鼠60只，随机分成四组：A正常对照组、B生理盐水组、C组CTX+BUS组、D组CTX+BUS+生理盐水组。C、D两组第1天以腹腔注射CTX负荷剂量50 mg/（kg·d），第2天开始8 mg/（kg·d）连续注射14 d，后皮下注射BUS10 mg/（kg·w），共2次。C组小鼠于第15天处死。D组于第15天开始注射生理盐水8 mg/（kg·d），共15 d，于第30天处死余组小鼠。在处理期间观察小鼠的一般情况、体重、各级卵泡数水平。以化学发光法测定各组小鼠血清中E2及FSH的水平，观察卵巢及肺组织常规病理切片下的形态学变化。 结果 与A、B组卵巢相比，C组E2 显著下降、FSH水平显著增加、各级卵泡数量减少（P<0.05）。C、D组相比，E2 下降、FSH增加（P<0.05），两组各级卵泡计数虽减少，但差异无统计学意义。A、B组中E2、FSH、卵泡数量比较，差异无统计学意义。C组与A、B、D组肺组织对比，肺组织血管内皮细胞水肿， 肺泡间隔内可见渗出液。A、B、C组肺组织形态无异常。 结论CTX+BUS使原始卵泡和初级卵泡的显著减少可能与小鼠卵巢中血E2下降有关，并且CTX+BUS也会造成一过性肺损伤。

[关键词] 卵巢损伤；性激素；一过性肺损伤

The effects of cyclophosphamide and busulfan on ovarian injuries and early lung injury

SHEN Yanling WU Hui HUANG Huan YIN Tian LI Pan ZHAO Pin WU Changchu LUO Wenqi

Changsha Medical University， Changsha 410219， China

[Abstract] Objective To assess the effects of cyclophosphamide （CTX） and busulfan （BUS） on ovarian injuries and initial injury of lung. Methods Sixty female SD rats age of 2 to 3 months were divided into four groups： group A （control group）， group B （saline group）， group C （CTX+ BUS group）， group D （CTX+BUS+saline group）. SD rats of group C and group D were processed by intraperitoneal injection of CTX 50 mg/（kg·d） at the 1st day and then 8 mg/（kg·d） from day 2， for 14 days. SD rats of group C and group D were processed by subcutaneous injection of BUS 10 mg/（kg·w） for twice， and SD rats of group C were killed at day 15， whereas SD rats of group D had been processing by 8 mg/（kg·d） saline for another 15 days， and all of SD rats were killed at day 30. General conditions， weight， number of levels of folliole of rats of four group were observel every day. Estrogen （E2） and follicular stimulating hormone （FSH） were detected by chemiluminescence method. The lung and ovaries of each group were prepared for HE sections. Results Compared with A， B group of ovarian， levels of E2， number of levels of follicular， FSH in the group C decreased and increased significantly （P<0.05）. Compared with group D， C， E2 decreased， FSH increased （P<0.05）， two groups of follicle count at all levels was reduced， but there was no statistically significant difference. In group B and A， E2， FSH， number of follicles were compared， there was no statistically significant difference. Group C compared with group A， B， D in lung tissue， lung tissue vascular endothelial edema， can be seen in the alveolar interval exudate. Lung tissue form of A， B， C group without exception. Conclusion CTX together with BUS can induce primodial follicles and primary follicles undergo atresia， which can be close to the decreased level of E2. CTX together with BUS can also induce transitory pulmonary injury in early stage.

[Key words] Ovarian injury； Sex hormone； Transitory pulmonary injury

近年来恶性肿瘤趋于年轻化，虽经化疗后患者的存活率显著提高，但同时对女性卵巢也造成一定的损害，如卵泡过早排空，包膜增厚，间质纤维化，进而卵巢早衰[1，2]。如今化疗药物对卵巢的副作用损伤已逐渐成为当今的研究热点。其中，CTX和BUS为细胞周期非特异性烷化剂，其毒性不仅作用于分裂增殖期细胞，也可作用于未发育的卵母细胞或原始卵泡中的前颗粒细胞，影响卵泡的发育和成熟[3]。另有报道部分化疗药物诱发肺纤维化所需的时间较长，患者发病隐匿，不易引人注意[4]。如何在化疗时保护卵巢功能和肺功能是亟待解决的问题。本实验选取经典化疗药物环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）和白消安（Busulfex，BUS），观察其对卵巢功能和肺功能损伤的影响，为深入探索化疗药物对卵巢功能及早期肺损伤的预防及治疗提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1实验动物

具有正常性周期2～3月龄的雌性Wister小鼠60只，体重（23±2）g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，使用准可证编号：SCXK（湘）2011-0003。全价颗粒饲料喂养，鼠料及饮用水均经灭菌处理，自由摄食，室温20℃～24℃，相对湿度45%～55%，每日光照12 h，昼夜交替。饲养1周后每日晨取阴道分泌物涂片，光镜下观察性周期。

1.2 实验药物

注射用环磷酰胺购自山西普德药业股份有限公司（粉剂，200 mg/支），国药准字：H14023686。白消安，购于Sigma公司，国药准字：B2635。实验时用生理盐水配成相应浓度的水溶液注射。

1.3 方法

1.3.1 分组及用药 将60只小鼠随机分成四组，每组15只。A组（正常组）。B组（生理盐水组）：每天腹腔注射同等剂量的0.9%生理盐水，连续30 d。C组（CTX+BUS组）和D组（CTX+BUS+生理盐水组）第1天以腹腔注射环磷酰胺负荷剂量50 mg/（kg·d），后以8 mg/（kg·d）的维持剂量连续注射14 d，注射环磷酰胺后皮下注射白消安10 mg/（kg·w），共2次。C组小鼠于第15天处死。D组于第15天开始注射生理盐水8 mg/（kg·d），共15 d，于第30天处死A、B、D组小鼠。以上所用动物均摘小鼠眼球以取血，4℃放置过夜后，2000 r/min离心10 min，分离血清于-20℃保存。用药期间观察小鼠一般状态（生命体征、进食情况、大小便、每日测体重1次）。

1.3.2 动情周期的确定 每天9：00取自制微细棉签蘸以0.9%生理盐水后，轻轻于小鼠阴道内旋转1圈，行阴道涂片，用95%乙醇固定5 min，显微镜下观察细胞的种类和形态。

1.3.3性激素水平的测定方法 采用化学发光法测定小鼠血清中的雌二醇（E2）、卵泡刺激素（FSH）水平，试剂盒为德国Bayer公司生产，严格按照试剂盒说明进行操作。

1.3.4 组织形态学观察 C组小鼠第15天处死，取出双侧卵巢及肺，第30天处死余下组的小鼠。进行石蜡切片后，HE染色并光镜下观察双侧卵巢和肺组织的形态学变化。分别计数各组小鼠的各级卵泡数并比较各组间的差异。

1.4 统计学处理

使用SPSS 12.0统计学软件进行统计分析，计量资料采用两样本t检验和单因素方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠的一般情况

A、B两组小鼠活动、摄食等一般情况正常，体重无下降，对外界刺激的反应性好，灵活性强。C、D两组小鼠在腹腔注射CTX及皮下注射BUS后，体重逐渐下降，活动减少，体毛黯淡无光泽，部分体毛剥脱，注射处皮肤出现小溃疡，但可自愈。C、D两组于处理后第2天小鼠体重即下降，至第15天体重达到最低值；结束注射化疗药后D组小鼠体重均略有增长，但仍低于对照组（t=6.776，P<0.05）。D组的体重与C组相比，差异有统计学意义（t=7.266，P<0.05）。A、B两组的体重比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2小鼠动情周期的测定

A、B组小鼠的动情周期为4～5 d，动情间期为1.5～2.5 d。A、B组涂片内上皮细胞、白细胞、角化细胞交替的周期性变化。C、D两组注入CTX及BUS后在出现较长时间上皮细胞及白细胞后，偶有一个角化细胞类型变化。随着时间的延长，角化细胞出现的频率减少。

2.3性激素水平的测定

注药结束后，C、D两组小鼠激素水平发生明显变化。与A组比较，C、D两组E2水平明显降低（t=33.999、24.682，P<0.05），FSH水平明显升高（t=-11.296、-14.333，P<0.05）。其中D组与C组比较E2浓度低，FSH比C组高，有显著性差异（t=12.276、-10.207，P<0.05）。A、B组E2、FSH的差异无统计学意义（t=0.036、0.702，P>0.05）。见表1。

2.4小鼠卵泡计数

C、D组各级卵泡数量低于A、B组（P<0.05），其中以原始卵泡及初级卵泡下降最为明显，D组与C组相比卵泡数均有下降，但差异无统计学意义（P>0.05），这说明CTX+BUS主要作用于原始卵泡和初级卵泡，影响卵泡的发育和成熟。见封三图2。

2.5 卵巢及肺形态学观察结果

HE染色后光学显微镜下观察，可见A、B组卵巢皮质的各级卵泡形态结构与髓质结构未见异常。肺组织形态结构也未见异常。C、D两组可见卵泡数目均明显减少，卵巢髓质萎缩，间质纤维化。C组肺组织血管内皮细胞水肿， 肺泡间隔内可见渗出液。D组内皮细胞和上皮细胞均正常，说明化疗药物可导致一过性肺损伤。见封三图3。

3 讨论

化疗是临床上治疗免疫性疾病、血液病和肿瘤的重要手段之一，疗效确切。化疗药物对靶细胞选择性较差，在杀灭病变细胞的同时，对正常组织细胞也有不同程度的损害。其中，女性卵巢是化疗敏感器官，化疗可造成卵巢功能损害，改变性激素水平，可使患者发生暂时或永久性闭经，甚至丧失生育力，生活质量下降。目前有明确卵巢毒性损害的烷化剂如环磷酰胺、白消安、氮芥等可致闭经、生育能力低下，其中白消安是联合化疗、手术的常用药物之一[5]，目前有数据表明每增加1.0 g剂量的环磷酰胺，发生卵巢功能衰竭的几率大约增加 0.13倍[6]。因此本研究选择CTX腹腔注射+BUS皮下注射处理小鼠进行观察，卵巢HE染色可见C、D组小鼠卵巢组织中原始卵泡和初级卵泡的明显少于正常组，说明CTX+BUS主要破坏处于发育中的卵泡，与王方圆的实验一致[7]。另外血清雌激素来源于卵巢的颗粒细胞，被视为卵巢储备功能的直接指标[8]。本研究显示，C、D组小鼠在给药后15 d，血清中E2显著下降，FSH显著上升，说明CTX+BUS损伤了卵巢的颗粒细胞从而使E2分泌下降，而D组继续给予同等剂量的生理盐水，在不伤害小鼠卵巢的情况下卵巢损伤的程度有所减慢，这可能与小鼠机体应激因素有关[9]。同时已有大量资料表明CTX可导致卵巢颗粒细胞的损伤，其机制为卵泡内的某种信号被激活而促进细胞发生凋亡[10]，而这种机制有学者提出Bcl-2/bax的比例决定卵泡是否接受诱导凋亡的信号[11]。目前，Bcl-2家族是较公认的凋亡调控因子之一，大量学者对此进行实验探究，梁欣韫研究自身免疫性卵巢早衰小鼠卵巢颗粒细胞凋亡发生率高，同时Bax蛋白的表达明显上升，Bcl-2蛋白的表达明显下降[12]。朱玲研究表明免疫性卵巢早衰大鼠Bcl-2蛋白的表达减弱，Bax蛋白的表达增加从而促进了卵泡过早过快的凋亡[13]。邱明宁进一步以山羊卵巢间质体外分离实验证实颗粒细胞凋亡及卵泡闭锁与局部Bax基因的表达有关[14]。此时有学者研究去卵巢大鼠外源性补充E2后，大鼠下丘脑各核团Bcl-2蛋白的表达增加，而Bax蛋白的表达减少或变化不明显的实验，证明了E2能调节Bcl-2/Bax的表达[15]。然而可能由于种属特异性，各实验结果存在差异。而本实验主要研究CTX+BUS对卵巢的破坏结果，主要是小鼠卵巢原始卵泡和初级卵泡的耗竭和E2的显著下降，其实验机制可能是化疗药物促使E2减少，从而异常激活Bax基因的表达，诱导卵泡凋亡甚至耗竭[16]，由此猜测原始卵泡和初始卵泡的显著减少可能与E2的下降有关，而E2与卵泡凋亡及bcl-2/Bax三者间调节具体的作用机制，有待后续的相关研究来证明。

另外，抗肿瘤药物可使很多恶性肿瘤患者受益，但这种获益是以药物毒性的产生为代价的，其中一部分患者可发生肺损伤。化疗药物是引起药物性肺损伤的重要原因，其中包括环磷酰胺、白消安、博来霉素等[17]。研究表明白消安治疗慢性粒细胞白血病2～3年后，可引起肺纤维化，且常因呼吸衰竭或并发肺炎而死亡[18]。有相关实验研究在治疗相关的剂量浓度范围内，环磷酰胺及白消安对肺的影响小[19]。本实验发现化疗第15天时小鼠HE染色示肺部损伤，第30天肺部HE肺组织内皮细胞及上皮细胞正常，考虑化疗药物使小鼠处于应激状态致早期肺损伤，停药后肺部结构恢复正常。

化疗对卵巢功能的影响可引起不孕，对年轻女性癌症患者化疗前如何评估化疗可能对生育功能产生的影响，从而使患者获得更好的卵巢功能和生育能力，是目前临床妇科肿瘤医师必须重视的课题，也是未来卵巢恶性生殖细胞肿瘤研究的方向。同时继续探讨化疗药物对早期肺功能的影响，相信经过研究者们的共同努力，将会为年轻女性癌症患者化疗后保留生育力和正常肺功能提供更多、更有效、更安全以及更经济的治疗方法[20]。

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